試劑
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實驗步驟
1.合成Nestin干擾序列
2.干擾序列退火
將正反向干擾序列以10μM濃度溶于ddH2O，按以下體系將正反向干擾序列退火形成雙鏈粘末端DNA：
10 μL Forward oligo
10 μL Reverse oligo
5 μL 10x NEB buffer 2
25 μL ddH2O
置于100度水，自然降溫
3.將Nestin干擾序列克隆至PLKO.1載體質粒
3.1 PLKO.1載體質粒酶切
AgeI HF+ EcoRI HF酶切pLKO.1載體質粒，體系如下：
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37°C孵育1.5h。(酶切時間可延長到＞2h)
瓊脂糖凝膠電泳，可見1kb和7kb兩個條帶，切膠回收7kb條帶（靠凹槽的那條）。
Run digested DNA on 0.8% low melting point agarose gel until you can distinctly see 2 bands, one 7kb and one 1.9kb. Cut out the 7kb band and place in a sterile microcentrifuge tube.
1、配制成1%瓊脂糖膠（0.5小時）0.7g+70ml 1TAE溶液（濃度越大，區分度越小），加10000的核酸染劑（amino acid stain）7μl。
2、電泳槽中，黑色為負電極，紅色為正電極，凹槽對著負極。大凹槽可加50μl，小凹槽可加10μl。
3、吸取5μl DL5000 DNA marker加入電泳槽。
4、吸取5μl 10*DNA loading buffer加入PLKO酶切液中。
5、參數設定100V，20min左右（條帶跑到膠中間比較合適）。
6、暴光200ms以上，觀看條帶。
When visualizing DNA fragments to be used for ligation, use only long-wavelength UV light. Short wavelength UV light will increase the chance of damaging the DNA.
7、剪下條帶，稱重。專用試劑盒，用1：1溶解液溶解（即若條帶重220ug，則用220ul溶解液）。60ul洗滌液洗2次，離心，去除下清液，甩干，加25ul DDH2O溶解，收集下清液。
8、測量雙酶切載體質粒濃度
3.2 連接
體系如下：
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(If you were unable to measure the DNA concentration, use 1 μL)
雙酶切載體質粒要測濃度，再算體積。
16°C孵育4-20h。
3.3 轉化
從-80℃冰箱取出DH5α感受態菌100ul（一般用20ul即可），立即放冰上緩慢溶解10min。
把2μL連接產物加入到感受態細胞中，放置冰上孵育30min。
于42℃熱激細胞30s~60s。
熱激完成后，立即將細胞轉移到冰上孵育2min。
加入250μL S.O.C. medium，然后在37℃、225 RPM的搖床里孵育1h。離心，即其中100ul，吹打細胞溶解。
把100μL轉化物涂板至100（50) μg/mL Amp的LB平板上，37℃孵育過夜。（倒置培養，即字在上面）
挑選出單菌落，選出重組子進行雙酶切檢測和測序。(挑出單菌落到LB + 100 μg/mL ampicillin的15ml離心管中，取1ml送測序)
4.慢病毒包裝與轉染
4.1慢病毒包裝方法：
a. 將293T細胞接種在10cm皿中，待其90%滿的時候換新鮮不含雙抗的293T培養液（DMEM+10%FBS)。
b.混合慢病毒載體質粒,目的質粒
In polypropylene microfuge tubes (do NOT use polystyrene tubes), make a cocktail for each transfection:
1 μg pLKO.1 shRNA plasmid
750 ng psPAX2 packaging plasmid
250 ng pMD2.G envelope plasmid
to 20 μl serum-free OPTI-MEM
c.(最好在下午或者晚上做)步驟a 2h后將慢病毒載體質粒，目的質粒混合加入無血清的OPTI-MEM培養基中（先加培養基，再加Lipo-fectamine 3000，最后加質粒。Lipo-fectamine 3000與質粒1：1加入，如2ul: 2ug。質粒需經驗性計算用量）Lipo-fectamine3000說明書推薦2種用量，可參考。
（靜置5min后加入X-treme HP，非常規），顛倒混勻后靜置15min，加入293T細胞中。
d. 12-16h左右換液( fresh DMEM + 10% FBS + penicillin/streptomycin)，繼續培養24h-48h左右，收集含有病毒的上清培養液(polypropylene storage tube),Spin media at 1,250 rpm for 5 minutes to pellet any HEK-293T cells that were inadvertently collected during harvesting.儲存于4℃冰箱
e. 慢病毒超速離心濃縮，棄上清，溶于1×PBS后，分裝保存于-80℃。（可以不離心，直接用上清培養液加入，一般是1ml培養液加1ml培養基）
4.2Determining the Optimal Puromycin Concentration：
Each cell line responds differently to puromycin selection. Addgene strongly recommends that you determine the optimal puromycin concentration for your cell line before initiating your experiment.
Day 1: a. Plate target cells in ten 6 cm plates and grow at 37° C, 5% CO2 overnight.
Day 2: b. The target cells should be approximately 80-90% confluent.
c. Dilute puromycin in the preferred culture media for your target cells. The final concentration of puromycin should be from 1-10 μg/mL in 1 μg/mL increments. d. Label plates from 1-10 and add appropriate puromycin-containing media to cells.
Days 3+: e. Examine cells each day and change to fresh puromycin-containing media every other day.
f. The minimum concentration of puromycin that results in complete cell death after 3-5 days is the concentration that should be used for selection in your experiments. (You may wish to repeat this titration with finer increments of puromycin to determine a more precise optimal puromycin concentration.)
4.3慢病毒轉染方法：
準備六孔板一個孔細胞，吸去細胞培養液，加入混勻了的病毒轉染液（950μL培養基+50μL濃縮病毒+1μL 1000×Polybrene），37℃，5% CO2培養箱中培養。12h后，更換回普通培養基。使用Puro（PLKO.1載體）或zeocin（pENTR223.1載體）篩選3~5天，純化轉染成功細胞株。PLL3.7載體轉染后，通過流式細胞儀分選GFP+細胞，純化轉染細胞株。
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