昆蟲表達體系是四大蛋白表達系統（原核細胞，酵母，昆蟲細胞，真核哺乳動物表達體系）之一。昆蟲表達系統的原理是通過將轉移載體中的表達組件轉座到大腸桿菌中增殖的桿狀病毒穿梭載體上，提取穿梭質粒DNA轉染昆蟲細胞后，得到的子代病毒即為重組病毒。將病毒上清侵染昆蟲細胞，獲得表達的重組蛋白。
昆蟲表達體系有很多優點：
1、具有糖基化，乙?；姿峄饔玫鹊鞍追g加工修飾；
2、易于操作。桿狀病毒基因組較小，分子生物學特性簡單；
3、昆蟲細胞懸浮生長，容易放大培養；
4、可表達較大的外源性基因而不影響本身增殖；
5、可以高效表達外源基因。
今天小優為大家介紹一篇中國農業科學院蜜蜂研究所近期發表的文章：蜂王漿主蛋白2在昆蟲細胞-桿狀病毒系統中的表達與鑒定
實驗步驟：
1、引物設計與合成
根據GenBank中已登陸的意大利蜜蜂MRJP2基因序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計MRJP2基因全長引物序列。
2、MRJP2基因擴增和克隆
從意大利蜜蜂頭部提取總RNA，以提取的RNA為模板，使用RT-PCR試劑盒進行反轉錄合成cDNA。以cDNA為模板，PCR擴增MRJP2基因。PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，膠回收試劑盒回收DNA。
將回收的DNA與pMD18-T克隆載體連接，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃培養過夜。挑選單克隆菌落，菌落PCR鑒定，并進行測序。
3、MRJP2-Bacmid重組桿狀病毒質粒構建
利用限制性內切酶Not I和Hind III分別對pFastBac1載體和MRJP2質粒雙酶切，酶切后的質粒和載體經瓊脂糖凝膠電泳分離，回收純化。MRJP2質粒和pFastBac1載體連接。取5ul連接產物轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，37℃培養過夜。挑選單克隆菌落，菌落PCR鑒定，并進行測序。
將測序正確的pFastBac1-MRJP2質粒轉化大腸桿菌DH10 Bac感受態細胞，37℃，220 r/min培養4h。復蘇完成后，用SOC培養基將轉化液進行10,100和1000倍梯度稀釋，每個稀釋梯度取100ul鋪LB平板（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml慶大霉素，7ug/ml四環素，40ug/ml X-gal，40ug/ml IPTG）。將平板倒置37℃恒溫培養箱培養48h，挑取白色單菌落，重新劃線LB平板培養基，37℃過夜。
挑選白色單菌落，轉接到LB培養液中（50ug/ml卡那霉素，7ug/ml慶大霉素，7ug/ml四環素），37℃，220r/min培養過夜。用桿狀病毒穿梭載體Bacmid小量抽提試劑盒提取MRJP2-Bacmid質粒，以該質粒為模板，利用通用測序引物M13-F/M13-R進行PCR鑒定。構建成功的質粒PCR產物為3680bp。（圖1）
4、重組蛋白的表達
用培養基在27℃，無CO2條件下講Sf9昆蟲細胞培養至細胞密度達70%-90%。用昆蟲轉染試劑將MRJP2-Bacmid質粒轉染到Sf9昆蟲細胞，同時設置轉染空質粒的Sf9細胞為陰性對照，繼續培養并注意觀察細胞形態。待所有細胞都裂解時，收集細胞培養液上清，即為P1代重組桿狀病毒。
使用P1代病毒感染貼壁約1h的Sf9細胞（2*106/ml），病毒感染復數為0.1。27℃培養72h后，收集培養液，500xg離心5min，獲得的上清為P2代桿狀病毒。
用P2代桿狀病毒感染處于對數生長期的Sf9昆蟲細胞，密度為1*106-2*106個/ml，MOI為10，感染72h。表達的MRJP2為分泌型蛋白，收集此時的細胞培養液，500xg離心5min并于4℃保存。
5、重組蛋白的純化及鑒定
將含有重組蛋白的上清液用超濾管進行過濾濃縮，棄流出物，保存截留物。利用AKTA儀器對濃縮后的樣品進行純化。先用Superdex 75 10/300 Increase凝膠過濾柱分離，SDS-PAGE跑膠檢測，然后用陰離子交換柱HiPrep Q XL進行進一步分離，SDS-PAGE跑膠鑒定。然后對純化蛋白進行質譜分析。
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