<American Journal of Cancer Research> ISSN: 2156-6976;2018_IF = 4.737; 2019_IF = 5.177;The University of Texas at Austin于今年8月發(fā)表在American Journal of Cancer Research上的整合腫瘤免疫網(wǎng)絡分析，研究針對于癌癥患者的體細胞免疫反應突變，開發(fā)出潛在的免疫應答(NIPPER)的網(wǎng)絡模型，發(fā)現(xiàn)該模型鑒定出的基因多與免疫治療相關(guān)，并可以作為藥物相關(guān)基因，進行免疫調(diào)節(jié)候選藥物篩查。小編看了一下Dr.Song實驗室和個人研究經(jīng)歷，著實優(yōu)秀的，有興趣可以瀏覽：https://www.bme.utexas.edu/people/faculty-directory/yi從ImmPort項目中獲得人體免疫相關(guān)基因(http://www.immport.org), 17個免疫相關(guān)通路共1811個基因。另外文獻挖掘到essential immunotherapy genes，定義為第18類免疫通路。所以最終涉及2273個免疫相關(guān)基因。通過R-package “TCGAbiolinks”從TCGA（http://cancergenome.nih.gov/）獲取33個癌癥項目類型包括生存狀態(tài)、階段、等級、生存時間和RNA-seq數(shù)據(jù)。Synapse獲取體細胞突變數(shù)據(jù)涉及10,224名患者，得到每個突變的保守和MetaSVM評分。免疫治療組的兩組基因表達數(shù)據(jù)，GSE35640 -- 接受MAGE-A3免疫治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者和GSE78220 -- 接受抗pd -1治療的黑色素瘤活檢樣本。此外，本研究還使用了來自ATCC細胞系，兩次傳代后用于實驗。BaF3和MCF10A兩株細胞系，通過與對應的野生型比對，測定細胞系突變的功能測評。根據(jù)TCGA中33類癌癥的基因表達數(shù)據(jù)估計混合細胞群體中成員細胞類型的豐富度，包括評估免疫評分、基質(zhì)評分和腫瘤純度。途徑突變負荷（PMB）評分是評估免疫途徑在特定癌癥類型中是否可能發(fā)生突變。該評分考慮了突變基因的比例以及每種癌癥類型的患者覆蓋率。對于j型癌癥中的免疫通路i，評分定義如下:
為了評估基于免疫基因差異表達的癌癥類型的相似性，計算了每對癌癥的Jaccard指數(shù)：在DEGi和DEGj是癌癥免疫基因的差異表達類型i和j。
根據(jù)差異表達分析衍生的FDR的負log10乘以logFC (log fold change)的符號對基因進行排序。“加權(quán)”富集統(tǒng)計數(shù)據(jù)用于計算特定癌癥類型中每個免疫通路的富集或缺失。使用NetMHCpan 4.0基于突變和信息進行新抗原預測HLA等位基因。提取8-11個氨基酸的野生型和突變型肽段，并預測其結(jié)合親和力。將預測的親和度排序與一組隨機的天然肽進行比較。強結(jié)合肽的Rank閾值為0.5%，弱結(jié)合肽的Rank閾值為2.0%。0.5%的cutoff值用于定義引起新抗原的突變。基于網(wǎng)絡的挖掘免疫相關(guān)基因和藥物：對免疫失調(diào)基因進行優(yōu)先排序，從一個完整的功能網(wǎng)絡中提取免疫相關(guān)基因形成的子網(wǎng)絡，該子網(wǎng)絡的主要組成部分包括1,202個免疫相關(guān)基因之間的6060個相互作用。然后根據(jù)基因表達與免疫評分、MHC評分、CYT評分的相關(guān)性對免疫基因進行排序。選擇與免疫、MHC、CYT評分正相關(guān)或負相關(guān)較高的50個基因作為種子基因。與免疫相關(guān)評分相關(guān)的突變基因也被整合為種子基因。random walk with restart算法模擬遺傳變異的延續(xù)。當一個免疫基因在網(wǎng)絡中排名在前50位時，初始值為“1”。然后將遺傳改變沿鄰域進行傳播，計算網(wǎng)絡中所有基因的遺傳改變概率，公式如下:P0是最初的二元概率向量,一個代表一個degree-normalized免疫子網(wǎng)的鄰接矩陣,和α決定通過網(wǎng)絡擴散程度的遺傳影響。分析確定α= 0.7為最優(yōu)值，多次迭代得到概率值，得分高于平均概率的基因被確定為每種癌癥類型的免疫失調(diào)基因。接下來，整合藥物相關(guān)基因標記，識別每種癌癥的候選藥物。我們首先從The Connectivity Map中獲得了表達特征基因 (也稱為CMAP)，每種藥物都有兩種特征基因，一種是上調(diào)基因，另一種是下調(diào)基因。使用超幾何檢驗來評估藥物干擾基因標記是否在癌癥特異性免疫基因集中富集。得到每種癌癥類型的p值，然后將33種癌癥類型的所有p值合并為一個組合p值。其中w為各p值的權(quán)值，z為各p值的z分數(shù)。這里，所有的p值設置相同的權(quán)重。選擇adjusted-pval小于0.01的藥物。我們獲得了具有上調(diào)/下調(diào)基因標記的藥物，這些標記富集了與免疫評分正/負相關(guān)的基因。根據(jù)特異性免疫基因的中位表達情況將患者分為兩組。采用Log-rank檢驗評價兩組患者的生存差異。p值小于0.05的基因被認為具有顯著性。捋清楚研究人員的課題設計，看一下最終腫瘤免疫到底呈現(xiàn)了一個什么樣的網(wǎng)絡以及是測評出的藥物基因有哪些。如圖1A所示，預測患者的免疫反應是可以用過基因標記實現(xiàn)的，這里首先評估三種不同的免疫基因表達特征是否與免疫治療反應相關(guān):1)免疫評分 2) MHC評分3)溶細胞活性。根據(jù)對MAGE - A3免疫治療反應的基因表達數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)對免疫治療有反應的患者具有明顯較高的免疫評分(p=0.003)、MHC評分(p=1.7e-4)和細胞溶解活性(p=0.007，圖1B)。此外，我們發(fā)現(xiàn)這三種免疫相關(guān)評分確實將有應答者與無應答者區(qū)分開來0.71-0.79(圖1C)。接著看一下評分在癌癥中的測評情況，計算TCGA中所有癌癥的患者的三項評分，如圖1D，免疫相關(guān)評分的分布是不同的。例如，腎透明細胞癌(KIRC)患者的腫瘤表現(xiàn)出較高的免疫相關(guān)評分，此外，雖然三個免疫相關(guān)評分似乎相互相關(guān)，但皮爾遜相關(guān)系數(shù)PCC范圍為0.51-0.79(圖1E)。結(jié)果表明，這些評分可能是互補的，因此整合這些評分將有助于鑒定新的候選基因靶點的免疫治療。2. 免疫突變負荷分析確定關(guān)鍵途徑和基因有研究表明，免疫通路的突變可能影響腫瘤免疫相互作用。這里展示的前文提到的18個免疫通路的2273個免疫基因與患者的預后關(guān)系。根據(jù)定義的通路突變負擔(PMB)評分，以評估腫瘤中基因組改變對每個免疫相關(guān)通路的干擾程度。發(fā)現(xiàn)由CRISPR-Cas9 KO篩查鑒定的必需基因在所有癌癥類型中PMB得分較高(圖2B)，此外在LUSC、SKCM和DLBC的另一條途徑-細胞因子受體（CRs）有較高的PMB評分。如圖2C所示，重點研究了LUSC中的CR突變，CR通路的突變表現(xiàn)為互斥模式。3. 人類免疫系統(tǒng)在癌癥中RNA水平的改變情況這里研究了在基因表達水平上人類免疫體多大程度上在癌癥中發(fā)生了改變。首先對每個樣本的腫瘤純度進行估計，并在回歸模型中以腫瘤純度為協(xié)變量對差異表達基因進行鑒定。發(fā)現(xiàn)與其他編碼基因相比，免疫相關(guān)基因在癌癥中顯著受到干擾（圖3A）此外發(fā)現(xiàn)，根據(jù)不同表達的免疫相關(guān)基因的相似性計算出每對癌癥的Jaccard指數(shù)，組織起源相似的癌系聚集在一起（圖3B），如肺腺癌(LUAD)和肺鱗狀細胞癌(LUSC)，膽管癌(CHOL)和肝肝細胞癌(LIHC)，以及三種腎癌。這些結(jié)果表明，這些類型的腫瘤在相似的腫瘤微環(huán)境中表現(xiàn)出免疫組特征。根據(jù)基因表達差異對所有基因進行排序，并使用基因集富集分析，16/18免疫相關(guān)通路在至少一種癌癥中發(fā)生顯著改變(圖3C)。現(xiàn)在乳腺浸潤性癌和膠質(zhì)母細胞瘤中，抗原處理和呈遞途徑可能被激活(BRCA和GBM，圖3C-D)。此外，細胞因子和細胞因子受體通路被抑制（BRCA和GBM，圖3E-F）。（圖3，人類免疫系統(tǒng)在癌癥中RNA水平的改變情況）4. 與免疫反應相關(guān)的關(guān)鍵基因區(qū)域考慮到免疫相關(guān)評分對預測免疫反應的重要性，接下來確定免疫候選驅(qū)動區(qū)域的癌癥突變是否與這些評分顯著相關(guān)，圖4A所示，145個免疫相關(guān)基因中有209個蛋白區(qū)域可能與癌癥免疫相關(guān)，七個基因(UBXN1, LTBP2, STAT1，NGFR、NRAS、MET和LTBP4)與三種免疫相關(guān)評分均顯著相關(guān)。發(fā)現(xiàn)病人EGF_CA結(jié)構(gòu)域突變顯著提高了免疫評分、MHC評分和細胞溶解活性(圖4B, p<0.05)。與免疫評分、MHC評分和細胞溶解活性相關(guān)的蛋白區(qū)域與TIIC豐度相關(guān)的蛋白區(qū)域明顯重疊(圖4C)。特別是與CD8 T細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞相關(guān)的蛋白區(qū)域數(shù)量更多。而圖4D展示的是， 7個基因的突變與所有三種免疫相關(guān)評分相關(guān)，它們與至少一種免疫細胞豐度相關(guān)。例如，LTBP4突變的患者CD8 T細胞和中性粒細胞的豐度明顯更高(圖4E)。這些結(jié)果表明，基因組的改變可能通過影響腫瘤的免疫細胞浸潤而促進免疫治療反應。（圖4，癌癥中免疫反應的關(guān)鍵蛋白區(qū)域）蛋白質(zhì)編碼基因突變導致的新抗原比例有限，大約1.2%的免疫相關(guān)基因突變可能產(chǎn)生新抗原(圖5A)。與一般編碼基因相比，免疫相關(guān)基因 (來自ImmPort) 傾向于產(chǎn)生更多的新抗原(如PIK3CA、MUC4、EGFR)(圖5A, p=1.18e-4, Fishertest)。PIK3CA和HRAS中大約25%的突變可以產(chǎn)生新抗原(圖5B)。這一結(jié)果與其他文獻中RAS在免疫治療中發(fā)揮作用的觀察結(jié)果一致。基于兩種細胞系(Ba/F3和MCF10A)的活性功能篩選，發(fā)現(xiàn)編碼新抗原的突變可能會激活兩種細胞系的突變(圖5C-5D)。在PIK3CA中鑒定了46個可能產(chǎn)生新抗原的錯義突變。在這些突變中，功能數(shù)據(jù)集中有41個突變。其中40個突變是激活突變，一個是滅活突變。此外，我們在PIK3CA中發(fā)現(xiàn)了一個突變簇(包括R38C/H、E81K、R88Q、R93W、K111E和R115L)(圖5 E)。對于EGFR，鑒定出17個突變可以產(chǎn)生新抗原。在兩個細胞系中，共有14個突變進行功能篩選，其中11個突變?yōu)榧せ钔蛔儯?個為中性突變，1個為非決定性突變(圖5D)。另外還發(fā)現(xiàn)7個突變形成了一個3D簇(包括R108K、R252/P/C/H和A189V/D，圖5E)。假設，導致蛋白構(gòu)象變化的功能性突變可能更容易被MHC分子識別以進行免疫剪枝，但如果這些突變隨后抑制炎癥信號，則可能會導致腫瘤細胞的增殖并激活突變。6. 基于免疫體網(wǎng)絡的候選免疫應答優(yōu)先排序上述結(jié)果表明，在癌癥免疫組網(wǎng)絡中廣泛存在基因組和轉(zhuǎn)錄組擾動。因此，研究人員提出了一個基于網(wǎng)絡的綜合模型來優(yōu)先考慮潛在的免疫應答基因(NIPPER)(圖6A)。簡單地說，首先確定了突變或表達與免疫評分、MHC評分和CYT評分顯著相關(guān)的基因。這些基因被映射到一個免疫相關(guān)蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡中，該網(wǎng)絡由1,202個免疫相關(guān)基因之間的6060個相互作用組成。接下來，突變效應在PPI網(wǎng)絡中傳播。最后，將驅(qū)動概率大于預期的基因確定為免疫應答相關(guān)的簽名基因。所有類型的癌癥都重復了這個過程。所有類型的癌癥都重復了這個過程。這里分別對與免疫相關(guān)評分正/負相關(guān)的基因進行分析。如6B,根據(jù)上述模型，確定了33種癌癥類型中的39個基因作為特征基因，這些基因的高表達可能與免疫相關(guān)評分相關(guān)。這些基因參與了11個免疫-相關(guān)通路，8個基因(如STAT1、B2M、TAP1、TAP2)已被確定為免疫應答的必要基因。此外，我們發(fā)現(xiàn)這些候選的免疫應答相關(guān)基因在PPI網(wǎng)絡中作為模塊聚集在一起 (圖6C)。研究人員還確定了一個候選基因——pdia3，它連接了7個已知的必需基因。并且在CESC、LUAD、HNSC和GBM等幾種癌癥類型中，該基因的表達與患者生存相關(guān)(圖6D)。接下來，對接受過T細胞轉(zhuǎn)移治療的黑色素瘤隊列中驗證了這些基因，發(fā)現(xiàn)這些基因的表達可以區(qū)分有反應者和無反應者，曲線下面積為0.713(圖6E)。這些基因的平均表達與總生存率的提高顯著相關(guān)(圖6F, log-rank p=0.02)。綜上這些結(jié)果表明，NIPPER所識別的信號網(wǎng)絡與多種免疫治療模式的反應有關(guān)，并可能對關(guān)鍵的信號級聯(lián)，從而有針對性地改善免疫治療的結(jié)果。（圖6，基于網(wǎng)絡的免疫應答器候選識別）最后評估了NIPPER在不同癌癥中發(fā)現(xiàn)的基因突變。在這里，對所有優(yōu)先基因突變的癌癥類型進行了分析。我們發(fā)現(xiàn)這些基因的突變可能改變HLAs的結(jié)合力(圖7A, p<0.001，Wilcox’s rank sum test)。具體地說，在28個基因中發(fā)現(xiàn)了135個突變，它們干擾了HLAs的結(jié)合，6個突變是降低HLAs結(jié)合力(圖7B)，還有一些突變聚集在a中可能的功能點（圖7C），而N564D和K567E突變可以促進癌細胞的生長(圖7D)。這些結(jié)果表明，我們的基于網(wǎng)絡的方法通過其與HLAs結(jié)合親和力的變化，有助于識別癌癥功能突變。另外，基于GESA分析，獲得了6000多個小分子及其微擾基因簽名圖，49個顯著干擾免疫基因簽名表達的小分子(p<0.05，圖7E)，所以綜上，這個基于網(wǎng)絡的模型，確實有篩選藥物的功能。
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