光致發(fā)光：分子吸收了光能而被激發(fā)至較高能態(tài)，在返回基態(tài)時，發(fā)射出 與吸收光波長相等或不等的輻射，這種現(xiàn)象稱為光致發(fā)光。
化學發(fā)光：化學反應中，產物分子吸收了反應過程中釋放的化學能而被激 發(fā)，在返回基態(tài)時發(fā)出光輻射。
熒光和磷光的產生
1、單重態(tài)和三重態(tài)
基態(tài)單重態(tài)(singlet state)：自旋電子成對,只有一種自旋方向↑↓, 電子自旋總和是零，光譜項的多重性是1，以S0表示 。
當基態(tài)電子激發(fā)到某高能級時, 將有兩種激發(fā)態(tài)：
即受激電子自旋相反與自旋平行: ↑↓h、↑↑h。
自旋平行時多重性 為M=2x1+1=3，稱為激受三重態(tài)（triplet state）用T表示， 自旋相反時多重性為1，稱為激受單重態(tài)，用S表示。
激發(fā)單重態(tài)S與激發(fā)三重態(tài)T的不同點：
⑴ S態(tài)電子自旋相反，T態(tài)電子自旋平行。
⑵ tS =
⑶ 基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)單重態(tài)的激發(fā)為允許躍遷，基態(tài)單重態(tài)到激發(fā)三重態(tài)的激發(fā)為禁阻躍遷。
⑷ 激發(fā)三重態(tài)的能量較激發(fā)單重態(tài)的能量低 。
2．分子內的光物理過程 （Jablonski圖）
輻射躍遷：
吸收：
熒光：S1最低振動能級—S0
磷光：T— S0
非輻射躍遷：
振動弛豫
內轉移
外轉移
系間竄躍
非輻射能量傳遞過程
振動弛豫：同一電子能級內以熱能量交換形式由高振動能級至低相鄰振動能級間的躍遷。
內轉換：同多重度電子能級中,等能級間的無輻射能級交換。通過內轉換和振動弛豫，高激發(fā)單重態(tài)的電子躍回第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級。
外轉換：激發(fā)分子與溶劑或其他分子之間產生相互作用而轉移能量的非輻射躍遷；外轉換使熒光或磷光減弱或“猝滅”。
系間竄躍：不同多重態(tài),有重疊的轉動能級間的非輻射躍遷。改變電子自旋，禁阻躍遷，通過自旋—軌道耦合進行。
輻射能量傳遞過程
熒光發(fā)射：電子由第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)， 多為 S1→ S0躍遷， 發(fā)射波長為 λ ‘2的熒光。由圖可見，發(fā)射熒光的能量比分子吸收的能量小，波長長；λ ‘2 > λ 2 > λ1 。
磷光發(fā)射：電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài)， T1 → S0躍遷；電子由S0進入T1的可能過程：（ S0 → T1禁阻躍遷）。
S0 →激發(fā)→振動弛豫→內轉移→系間跨越→振動弛豫→ T1
發(fā)光過程很慢。光照停止后，可持續(xù)一段時間。
光譜曲線
1、激發(fā)光譜：
ex max最大激發(fā)波長 發(fā)射光譜：
em max最大發(fā)射波長
熒光（fluorescence)
磷光（phosphorescence）
熒光光譜特征：
（1）Stokes位移
（2）ex一般不影響em sp的形狀
（3）吸收光譜與em sp的鏡像關系
2、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的關系
a. Stokes位移
激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間的波長差值。發(fā)射光譜的波長比激發(fā)光譜的長，振動弛豫消耗了能量。
b. 發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關
電子躍遷到不同激發(fā)態(tài)能級，吸收不同波長的能量(如能級圖λ2 ,λ1)，產生不同吸收帶，但均回到第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級再躍遷回到基態(tài)，產生波長一定的熒光(如λ‘2 )。
c. 鏡像規(guī)則
通常熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜（與激發(fā)光譜形狀一樣）成鏡像對稱關系。
3、鏡像規(guī)則的解釋
基態(tài)上振動能級分布與第一激發(fā)態(tài)上振動能級分布類似 ；基態(tài)零振動能級與第一激發(fā)態(tài)v振動能級間躍遷幾率與激發(fā)態(tài)零振動能級與基態(tài)v振動能級間躍遷幾率相近。
熒光的影響因素
1. 分子產生熒光必須具備的條件
（1）具有合適的剛性與共平面結構
（2）分子內及分子環(huán)境中沒有誘導非輻射躍遷基團
滿足以上條件的分子具有一定的熒光量子產率。
量子產率：熒光物質發(fā)射光子數(shù)與吸收激發(fā)光子數(shù)之 比（當非輻射躍遷A返回基態(tài)的概率很小時，φF接近于1， 在通常情況下，φF總是小于1的）
熒光量子產率取決于熒光過程與非輻射躍遷過程的相對速率：
大多數(shù)的熒光物質的量子產率在0.1~1之間；例如：0.05mol/L的硫酸喹啉，ΦF=0.55 。 熒光素 ΦF=1
2．熒光與有機化合物的結構
（1）躍遷類型：π* → π 的熒光效率高，系間跨越過程的速率常數(shù)小，有利于熒光的產生。
（2）共軛效應：提高共軛度有利于增加熒光效率并產生紅移 。
（3）剛性平面結構：可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用，故具有很強的熒光。如熒光素和酚酞有相似結構，熒光素有很強的熒光，酚酞卻沒有。
（4）取代基效應： 芳環(huán)上有供電基，使熒光增強。
3．熒光與金屬螯合物
(1)配體發(fā)光
(2)金屬發(fā)光
4 ．溫度的影響
一般說來，大多數(shù)熒光物質的溶液隨著溫度的降低，熒光效率和熒光強度將增加，相反，溫度升高熒光效率將下降。如熒光素的乙醇溶液在0℃以下每降低10 ℃，熒光效率增加3%，冷至-80℃時，熒光效率為100%。
5．熒光熄滅（猝滅）
熒光物質分子與溶劑或其它溶質分子相互作用，引起熒光強度降低甚至消失的現(xiàn)象。
1) 動態(tài)猝滅
2) 靜態(tài)猝滅
3) 熒光能量轉移
4) 內濾效應
1) 動態(tài)猝滅
動態(tài)猝滅（或碰撞猝滅）指激發(fā)態(tài)熒光分子與環(huán)境分子動態(tài)接觸而使熒光分子由激發(fā)態(tài)通過非輻射躍遷回到基態(tài)的現(xiàn)象。常見猝滅劑包括O2、I-、Cs+、丙烯酰胺。
Sterm-Volmer方程：F0初始熒光；F猝滅后熒光；Q猝滅劑；Ksv猝滅常數(shù)
動態(tài)猝滅使熒光壽命降低
Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)，正比于兩分子擴散系數(shù)和；
t0為無猝滅時熒光壽命。一般而言：
2) 靜態(tài)猝滅
靜態(tài)猝滅（或基態(tài)復合物猝滅）指基態(tài)態(tài)熒光分子與環(huán)境分子結合形成穩(wěn)定的、無熒光的復合物的現(xiàn)象。
Ka為復合物的結合常數(shù)
靜態(tài)猝滅只是改變熒光分子數(shù)目，而不改變熒光分子壽命
3) 熒光共振能量轉移
所謂熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer ，F(xiàn)RET)是指當一個熒光分子(又稱為供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(又稱為受體分子) 的激發(fā)光譜相重疊時, 供體熒光分子的激發(fā)能誘發(fā)受體分子 發(fā)出熒光, 同時供體熒光分子自身的熒光強度衰減的現(xiàn)象。
能量傳遞的效率：
R 0 ：Foster臨界距離， 為能量傳遞達到 50% 的距離
用途：應用能量轉移測量分子內和分子間的距離（一般測量距離為 0.5~1.5R0)
4) 內濾效應
當溶液中包含吸收熒光激發(fā)光或發(fā)射光的吸光物質時，入射光由于被吸收或者發(fā)射光被吸收均會導致熒光強度降低的現(xiàn)象。
5）自熄滅與自吸收
當熒光物質的濃度大于1g/L時，常發(fā)生熒光的自熄滅(濃度熄滅)
熒光強度的定量關系
光吸收定律（Lambert – Beer Law）
熒光分析儀器
熒光分析儀器框圖
熒光分光光度計部件
1．光源：鎢燈、汞燈、氙燈、激光
激發(fā)光源應具有穩(wěn)定性好、強度大、適用波長范 圍寬等特點。
其中穩(wěn)定性：影響測定的重現(xiàn)性和精密度。
強度：影響測定的靈敏度。
2．單色器：濾光片、光柵 激發(fā)單色器和發(fā)射單色器
3．檢測器
PMT Photomultiplier
CCD Charge Coupled Device
CID Charge Injected Device
問題：紫外-可見分光光度計的吸收池與熒光分光光度計的 有什么區(qū)別？
光源、單色器、光路、樣品池
光源：
紫外-可見分光光度計的光源為氘燈與鎢燈
熒光分光光度計的光源為氙燈，強度更大
單色器：
紫外-可見分光光度計的只有一個單色器
熒光分光光度計的包含激發(fā)、發(fā)射兩個單色器
光路：
紫外-可見分光光度計入射光與透射光在同一直線上
熒光分光光度計激發(fā)光與發(fā)射光相互垂直
樣品池：
紫外-可見分光光度計的吸收池兩面透光
熒光分光光度計的樣品池四面透光
熒光分析方法的特點及應用
1．特點
靈敏度高：比紫外-可見分光光度法高2～4個數(shù)量級；
檢測下限：0.1～0.1ug/cm-3 在合適的條件下，可以達到單分子水平
2．應用
定性分析：依據(jù)不同結構的物質所發(fā)射的熒光波長不同。
定量分析：同種物質的稀溶液，其產生的熒光強度與濃度呈線性關系。
直接熒光測定法
熒光化合物很少，主要依賴于有機試劑形成的熒光產物。例如，自應用鋁—桑色素配合物的熒光進行鋁的測定以來，采用有機試劑可以測定70多種元素。
熒光熄滅測定法
某些物質雖然不與有機試劑形成發(fā)熒光的配合物，但是它會猝滅發(fā)熒光的化合物，由熒光熄滅的強度此該元素的含量。
磷光分析法
1．如何獲得較強的磷光
磷光發(fā)射：
電子由第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級 →基態(tài)， T1 → S0躍遷。
電子由S0進入T1的可能過程（ S0 → T1禁阻躍遷）
2．磷光分析儀器
熒光計上配上磷光測量附件即可對磷光進行測量。在有熒光發(fā)射的同時測量磷光。
· 液槽
· 斬波片
測量方法：
（1）通常借助于熒光和磷光壽命的差別，采用磷光鏡的裝置將熒光隔開。
（2）采用脈沖光源和可控檢測及時間分辨技術。
化學與生物發(fā)光分析法
1. 化學發(fā)光反應（Chemiluminescence）
在化學反應過程中，某些化合物接受能量而被激發(fā)，從激發(fā)態(tài)返回基態(tài)時， 發(fā)射出一定波長的光。
（1）能夠發(fā)光的化合物大多為有機化合物，芳香族化合物；
（2）化學發(fā)光反應多為氧化還原反應，激發(fā)能與反應能相當
△E=170～300 kJ/mol；位于可見光區(qū)。
（3）發(fā)光持續(xù)時間較長，反應持續(xù)進。
化學發(fā)光反應如果存在于生物體(螢火蟲、海洋發(fā)光生物)中，稱生物發(fā)光（ bioluminescence ）
2.化學發(fā)光效率
3. 化學發(fā)光強度與化學發(fā)光分析的依據(jù)
在化學發(fā)光分析中，被分析物相對于發(fā)光試劑少得多， 對于一級動力學反應：dc/dt =Kc；K 為反應速率常數(shù)。
定量依據(jù)：
（1）在一定條件下，峰值光 強度與被測物濃度成線性；
（2）在一定條件下，曲線下面積為發(fā)光總強度(S)， 其與被測物濃度成線性：
4. 裝置與技術
發(fā)光反應可采用靜態(tài)或流動注射的方式進行：
靜態(tài)方式：用注射器分別將試劑加入到反應器中混合， 測最大光強度或總 發(fā)光量；試樣量小，重復性差。
流動注射方式：用蠕動泵分別將試劑連續(xù)送入混合器，定時通過測量室，連續(xù)發(fā)光，測定光強度；試樣量大。
5. 特點
· 靈敏度高
例：熒光素酶和磷酸三腺甙(ATP)的化學發(fā)光分析，可測定 2x
· 儀器設備簡單
不需要光源、單色器和背景校正。
· 無需發(fā)射光，無背景光、散射光等干擾
· 線性范圍寬 。
缺點：可供發(fā)光用的試劑少， 應用范圍較有限。
發(fā)光反應的類型與應用
1. 液相中的化學發(fā)光反應
1）應用最多的發(fā)光試劑：魯米諾（3-氨基苯二甲酰肼）
化學發(fā)光反應效率：0.15～0. 05
魯米諾在堿性溶液中與雙氧水的反應過程：
魯米諾- H2O2發(fā)光反應可檢測低至
魯米諾- H2O2發(fā)光反應速度慢，某些金屬離子可催化反應。利用這一現(xiàn)象可間接測定這些金屬離子。可測痕量的Cu2+ 、 Mn2+、Co2+、V4+、Fe2+、 Fe3+、 Ni2+、Ag+、Au3+、Hg2+等
通過測定生成的H2O2 ，間接測定某些生物試樣，如確定氨基酸、葡萄糖含量。
2）草酸二酯(能量提供體)+高濃度雙氧水+稠環(huán)芳烴(能量接受體)+金屬離子+溶劑組成的反應體系，可發(fā)出很強的可見光 ，發(fā)光效率高，使用不同的稠環(huán)芳烴，發(fā)射出不同顏色的光( 冷光源)。
2. 生物發(fā)光（Bioluminescence）
生物發(fā)光是化學發(fā)光中的一類， 特指在生物體內通過化學反應產生的發(fā)光現(xiàn)象，主要由酶來催化產生的。多種 細菌、昆蟲、魚類等均能發(fā)光。可用于環(huán)境質量監(jiān)測。
生物發(fā)光原理： 在生物發(fā)光分析中，通常同時涉及到酶促反應和發(fā)光反應。在pH為 7-8的介質中，在熒光蟲素酶（E）和Mg(II)離子的存在下，熒光蟲素 （LH2）與ATP反應，生成磷酸腺苷（AMP）熒光蟲素和熒光蟲素酸的 復合物及鎂的焦磷酸鹽（ppi）。其反應如下：
3. 電化學發(fā)光/電致發(fā)光
在電極表面由電化學引發(fā)的特異性化學發(fā)光反應，實際上包括了電化學和化學發(fā)光二個過程。
