▋ 王利 1， 丘倚靈 1,2， 王建設(shè) 1,2
1 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院
2 復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院
肝臟具有解毒、代謝、合成糖原及白蛋白、分泌膽汁等重要功能，對(duì)于維持人體生理穩(wěn)態(tài)具有重要作用。肝臟由不同細(xì)胞類型構(gòu)成，包括上皮細(xì)胞（即肝細(xì)胞和膽管細(xì)胞）、Kupffer細(xì)胞、單核細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、竇狀內(nèi)皮細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞、肝樹突狀細(xì)胞等。各種原因?qū)е碌母闻K疾病已成為全球最主要死亡原因之一。所以，深入了解肝細(xì)胞生理功能及相關(guān)疾病機(jī)制、提供有效的治療方法，顯得十分迫切。遺憾的是，經(jīng)典研究模型存在以下限制：人原代肝細(xì)胞/膽管細(xì)胞難以獲得，且體外不能長(zhǎng)期培養(yǎng)及維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能；細(xì)胞系、細(xì)胞株、小鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物遺傳代謝機(jī)制與人有較大差異，導(dǎo)致研究結(jié)果進(jìn)行臨床轉(zhuǎn)化存在困難。因此亟需更加貼近人肝細(xì)胞的模型進(jìn)行實(shí)驗(yàn)及治療研究。新興的類器官培養(yǎng)技術(shù)以其具有接近人體生理狀態(tài)的細(xì)胞組成和類似的三維組織結(jié)構(gòu)，成為近年來研究的熱點(diǎn)。
1 肝類器官的培養(yǎng)過程
類器官是由多能干細(xì)胞或成體干細(xì)胞在體外培養(yǎng)而自身聚合形成的三維組織結(jié)構(gòu)，可包含多種細(xì)胞類型，具有與原生器官類似的結(jié)構(gòu)和功能。2013年，來自歐洲及日本的課題組分別報(bào)道了應(yīng)用LGR5+干細(xì)胞及誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 (iPSC)構(gòu)建肝類器官的培養(yǎng)方案，開啟了肝類器官的研究。肝類器官培養(yǎng)起始細(xì)胞來源較多，包括多能干細(xì)胞、原代肝臟組織等，亦有利用肝腫瘤細(xì)胞系/組織構(gòu)建肝臟相關(guān)腫瘤類器官的報(bào)道。
利用各類干細(xì)胞進(jìn)行肝類器官培養(yǎng)主要采用逐步誘導(dǎo)分化方案（以iPSC為例）：將iPSC逐步誘導(dǎo)至終末內(nèi)胚層，再到前腸祖細(xì)胞，然后至成肝細(xì)胞階段后通過加入成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、維甲酸、活化素A等向膽管細(xì)胞類器官分化，加入肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、抑瘤素M等向肝細(xì)胞類器官分化。亦有研究團(tuán)隊(duì)提出在iPSC源性類器官經(jīng)典培養(yǎng)基中加入25%MTeSR（主要是成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2、維生素C等）以同時(shí)誘導(dǎo)其向內(nèi)胚層和小部分中胚層分化，最終可實(shí)現(xiàn)肝細(xì)胞樣細(xì)胞與膽管細(xì)胞樣細(xì)胞的共分化，在培養(yǎng)的最后階段加入膽固醇混合物促進(jìn)肝-膽類器官的形成與成熟。
新鮮分離或通過組織保存液凍存的原代肝組織均可培養(yǎng)肝類器官，已成功建立小鼠、人、狗、貓肝類器官，具體的方案是：對(duì)肝組織的LGR5+細(xì)胞進(jìn)行篩選，然后在肝類器官增殖培養(yǎng)基（主要包括內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、R-spondin、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子10、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子及煙酰胺）中進(jìn)行培養(yǎng)。不斷更新的研究中通過加入TGFβ受體抑制劑A8301以及CAMP信號(hào)通路激動(dòng)劑FSK對(duì)培養(yǎng)條件進(jìn)行改良，提高了類器官擴(kuò)增效率。LGR5+細(xì)胞是一種具有雙向潛能的肝干細(xì)胞，其本質(zhì)是一種膽管細(xì)胞，類器官由該細(xì)胞生發(fā)，所以在增殖培養(yǎng)基中類器官形態(tài)更接近于膽管細(xì)胞類器官，進(jìn)一步在肝類器官分化培養(yǎng)基中可以獲得肝細(xì)胞類器官以及促進(jìn)類器官更加成熟。不難看出整個(gè)培養(yǎng)過程分增殖和誘導(dǎo)分化兩個(gè)階段。在增殖階段可直接進(jìn)行傳代培養(yǎng)，細(xì)胞接近肝祖細(xì)胞的狀態(tài)，最終可實(shí)現(xiàn)鼠肝類器官大于1年的擴(kuò)增，人肝類器官目前可實(shí)現(xiàn)3個(gè)月左右的擴(kuò)增；在分化階段可進(jìn)一步促進(jìn)類器官實(shí)現(xiàn)其功能。肝腫瘤細(xì)胞系/組織來源的肝類器官培養(yǎng)方法與原代組織源性肝類器官類似。所有肝類器官培養(yǎng)方案均強(qiáng)調(diào)基質(zhì)膠（matrigel）為細(xì)胞生長(zhǎng)提供三維空間的重要作用。
2 肝類器官主要類型
2.1 肝細(xì)胞類器官
由于缺乏有效的研究肝臟疾病的工具細(xì)胞，最初提出了將干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為肝細(xì)胞樣細(xì)胞的體外方案。但肝細(xì)胞樣細(xì)胞仍不能滿足實(shí)驗(yàn)需求，2013年，Takebe等利用iPSC源性的肝細(xì)胞樣細(xì)胞與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞和人間充質(zhì)干細(xì)胞在基質(zhì)膠涂層板上共培養(yǎng)，產(chǎn)生了類似人肝芽組織的3D聚合物，這是最初iPSC源性肝細(xì)胞類器官的雛形。同一時(shí)期，Huch等利用原代肝臟組織同樣培養(yǎng)出肝細(xì)胞類器官。
2.2 膽管細(xì)胞類器官
膽管細(xì)胞類器官的產(chǎn)生過程與肝細(xì)胞類器官類似，且比肝細(xì)胞類器官更易于培養(yǎng)、穩(wěn)定性更高。膽管細(xì)胞類器官的典型形態(tài)是單層上皮樣細(xì)胞圍成的含有內(nèi)腔的囊樣或管樣結(jié)構(gòu)，類似于體內(nèi)膽管的結(jié)構(gòu)形態(tài)，可表達(dá)特異性膽管標(biāo)志物，具有膽管的相關(guān)功能。另外，將肝外膽管細(xì)胞類器官種植在空心圓柱形可降解支架上，還可獲得生物膽管并試用于肝外膽管疾病的替代治療。
2.3 肝-膽類器官
肝臟是一個(gè)多細(xì)胞組成的具有復(fù)雜功能的器官，單細(xì)胞類器官并不能完全概括肝臟功能。2017年，Guan等首次利用iPSC實(shí)現(xiàn)了肝膽細(xì)胞共分化，產(chǎn)生了肝-膽類器官。2018年，Hu等利用原代肝組織培養(yǎng)出了具有小膽管結(jié)構(gòu)的肝類器官。目前，尚無統(tǒng)一的肝-膽類器官培養(yǎng)方案，在不斷改進(jìn)與更新中，最近實(shí)現(xiàn)了從人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞分化出包含肝細(xì)胞、膽管細(xì)胞、星狀細(xì)胞以及Kupffer細(xì)胞的多細(xì)胞性肝類器官。包含多種細(xì)胞類型的肝類器官較最初的單細(xì)胞性肝類器官而言，更加接近肝臟的生理狀態(tài)，結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定，功能亦更加成熟，具有諸如白蛋白分泌、藥物代謝相關(guān)酶活性、糖原合成、低密度脂蛋白攝取等肝臟基本功能，還能夠表達(dá)各極性膜面轉(zhuǎn)運(yùn)體。
多細(xì)胞肝類器官與單細(xì)胞肝類器官相比，可實(shí)現(xiàn)更貼近真實(shí)人類肝臟的代謝過程。另外，原代組織來源的肝類器官相較于多能干細(xì)胞來源的肝類器官，在長(zhǎng)期培養(yǎng)過程中很少發(fā)生拷貝數(shù)變異或其他基因組結(jié)構(gòu)變異，能夠很好的反映并穩(wěn)定維持取材個(gè)體的遺傳特性，或許在類器官培養(yǎng)中會(huì)更具優(yōu)勢(shì)。
3 肝類器官的主要應(yīng)用
3.1 疾病模型構(gòu)建
類器官能夠提供有關(guān)器官發(fā)育、穩(wěn)態(tài)維持以及發(fā)病機(jī)制的基本信息，有望為疾病的診斷與治療提供新的方法。迄今，已有不同種類肝臟疾病模型成功構(gòu)建。
3.1.1 單基因遺傳病
Sampaziotis等利用患者來源的iPSC成功構(gòu)建了多囊性肝病和囊性纖維化相關(guān)性肝病的體外模型。Nantasanti等利用銅代謝缺陷狗(COMMD1-/-)的肝組織分化出肝細(xì)胞類器官，成功模擬了類似人肝豆?fàn)詈俗冃灾屑?xì)胞內(nèi)銅堆積的疾病表現(xiàn)，并證實(shí)存在銅排泄障礙；而通過載有COMMD1基因序列的慢病毒感染缺陷類器官后，銅代謝障礙表型得到糾正。Huch等利用Alagille綜合征、α-抗胰蛋白酶缺陷病患者原代肝組織成功培養(yǎng)出疾病特異性類器官，對(duì)Alagille綜合征類器官行KRT19染色，觀察到膽管細(xì)胞缺乏且不能形成完整的膽管上皮，殘存于類器官管腔的膽管細(xì)胞亦逐漸凋亡；在α-抗胰蛋白酶缺陷類器官內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中觀察到突變體蛋白的錯(cuò)誤折疊與堆積，同時(shí)，ELISA檢測(cè)證實(shí)了A1AT蛋白分泌減少，且類器官培養(yǎng)上清液抑制彈性蛋白酶活性的能力下降。
3.1.2 先天性肝臟疾病
Lorent等將鼠膽管細(xì)胞類器官暴露于與膽道閉鎖發(fā)病相關(guān)的一種植物性毒性物質(zhì)biliatresone中，觀察到類器官管腔變窄、其單層上皮樣結(jié)構(gòu)完整性遭到破壞以及膽管細(xì)胞失去其頂-基底極性，進(jìn)一步確定biliatresone可致膽道閉鎖，也證實(shí)了類器官可用于構(gòu)建膽道閉鎖疾病模型并探索相關(guān)發(fā)病機(jī)制。
3.1.3 代謝性疾病
Ouchi等將肝類器官暴露于游離脂肪酸中，可以觀察到脂質(zhì)堆積于類器官，并且類器官脂肪變性的程度隨著培養(yǎng)環(huán)境中游離脂肪酸的量增加而加重，還可觀察到炎癥反應(yīng)及纖維化等表型；進(jìn)一步在溶酶體酸性脂肪酶基因缺陷患者來源的類器官中觀察到嚴(yán)重的脂肪性肝炎表現(xiàn)，加入法尼酯X受體激動(dòng)劑FGF19后，其表型減輕。
3.1.4 傳染感染性疾病
肝類器官可進(jìn)行病毒感染，能夠進(jìn)行傳染性肝臟疾病的構(gòu)建。Baktash等利用HCV感染肝癌細(xì)胞來源的類器官，構(gòu)建了HCV的疾病模型，通過與二維細(xì)胞培養(yǎng)相比，其感染效率更高。另外，該模型能夠表達(dá)HCV定位依賴因子清道夫受體BI、CD81、表皮生長(zhǎng)因子受體等，進(jìn)一步進(jìn)行了HCV定位于肝細(xì)胞的機(jī)制研究。同樣，利用HCV感染iPSC源性的肝類器官構(gòu)建了HCV性肝炎疾病模型。相較于二維細(xì)胞培養(yǎng)，運(yùn)用肝類器官能夠更好的反應(yīng)病毒與宿主之間的相互作用。迄今，另有利用腦類器官構(gòu)建寨卡病毒感染疾病模型并復(fù)現(xiàn)了相關(guān)表型以及進(jìn)行了相關(guān)發(fā)病機(jī)制的探索，未來也有望利用肝類器官研究其他肝臟相關(guān)感染性疾病。
3.1.5 肝臟腫瘤類器官
2017年，Broutier等在肝類器官經(jīng)典培養(yǎng)方案基礎(chǔ)上，去除Respondin-1、Noggin和Wnt3a，添加地塞米松以及Rho激酶抑制劑，同時(shí)增加肝腫瘤組織消化時(shí)間，首次成功培養(yǎng)出肝細(xì)胞癌類器官、膽管細(xì)胞癌類器官和混合細(xì)胞癌類器官。隨后各種肝臟腫瘤患者來源的類器官豐富著腫瘤類器官生物庫(kù)。此外，結(jié)合CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，可以將不同癌癥基因的變異引入正常類器官，實(shí)現(xiàn)了從正常組織獲得腫瘤類器官。最新有提出通過模擬腫瘤微環(huán)境以細(xì)胞共培養(yǎng)的方式產(chǎn)生腫瘤類器官，有望更好地應(yīng)用于腫瘤免疫學(xué)及治療反應(yīng)研究。
3.2 藥物篩選
一直以來，肝臟腫瘤的研究都缺乏能夠完整重現(xiàn)原發(fā)腫瘤病理生理的體外模型，同時(shí)也限制了腫瘤治療藥物的研發(fā)。類器官技術(shù)的出現(xiàn)為腫瘤藥物的篩選提供了良好的實(shí)驗(yàn)平臺(tái)。利用原發(fā)性肝癌的腫瘤不同區(qū)域的活檢組織進(jìn)行類器官培養(yǎng)，所得到的腫瘤類器官不但可以重現(xiàn)來源腫瘤的組織結(jié)構(gòu)及不同區(qū)域細(xì)胞的突變特征，體外長(zhǎng)期擴(kuò)增還可保持遺傳穩(wěn)定性，不改變腫瘤的病理類型。因此，腫瘤類器官已經(jīng)成為臨床前藥物篩選模型，能夠預(yù)測(cè)個(gè)體患者對(duì)療法的反應(yīng)。Broutier等揭示了不同原發(fā)性肝臟腫瘤的基因突變譜對(duì)治療藥物具有不同的敏感性，例如CTNNB1突變的肝細(xì)胞癌源性的類器官對(duì)wnt抑制劑LGK974耐受，但膽管細(xì)胞癌源性的類器官則對(duì)其敏感；此外，對(duì)腫瘤類器官進(jìn)行藥物篩選，還發(fā)現(xiàn)一種僅被批準(zhǔn)用于肝細(xì)胞癌的治療藥物——索拉非尼，對(duì)于一些特定類型膽管細(xì)胞癌也有一定的治療前景。因此，可以借助類器官模型，建立一個(gè)包含腫瘤類型、主要突變形式以及敏感或耐受藥物的數(shù)據(jù)庫(kù)，以為腫瘤患者快速確定合適的治療方案，從而實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。Vlachogiannis等利用結(jié)腸癌、胃食管癌患者來源類器官預(yù)測(cè)靶向藥物及化療藥物療效，具有很高的敏感性與特異性?？梢婎惼鞴僖嗍穷A(yù)測(cè)抗癌藥物療效的良好工具，可應(yīng)用于肝臟腫瘤藥物的療效預(yù)測(cè)，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。另外，利用囊性纖維化相關(guān)性肝病患者來源的膽管細(xì)胞類器官，對(duì)該病治療藥物VX809和VX770進(jìn)行療效篩選，為實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療提供了研究手段。
3.3 藥物毒性測(cè)定
藥物的肝毒性是限制其研發(fā)與應(yīng)用的主要障礙之一。使用細(xì)胞系和動(dòng)物模型進(jìn)行藥物毒理學(xué)研究通常不能準(zhǔn)確預(yù)測(cè)其在人體內(nèi)的不良反應(yīng)。類器官具有人源性、遺傳穩(wěn)定性以及可實(shí)現(xiàn)高通量篩選等優(yōu)勢(shì)，能夠?yàn)樗幬锒拘詼y(cè)定提供更精確的方式。目前，美國(guó)食品與藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)開始嘗試?yán)酶晤惼鞴龠M(jìn)行食品添加劑、營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑和化妝品的肝毒性測(cè)定。類器官將會(huì)是肝毒性藥物篩選的良好工具。
3.4 細(xì)胞治療
Takebe等在首次通過細(xì)胞共培養(yǎng)的方式獲得iPSC源性類器官后，將其移植入藥物誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠體內(nèi)，觀察到類器官迅速填充小鼠肝臟并可提高小鼠的存活率及存活時(shí)間。同樣地，將增殖階段的人肝類器官移植入具有肝衰竭表現(xiàn)的Ⅰ型酪氨酸血癥小鼠(Fah-/-)體內(nèi),類器官可在體內(nèi)增殖并填充肝臟受損部分。此外，結(jié)合CRISPR-Cas9還可對(duì)類器官進(jìn)行基因編輯，對(duì)于一些基因疾病可以實(shí)現(xiàn)精確的基因治療。目前細(xì)胞治療處于臨床前實(shí)驗(yàn)階段，尚需要更多的研究評(píng)估其安全性與有效性，以便能實(shí)現(xiàn)臨床適用性。
3.5 組織重建類
器官培養(yǎng)的自發(fā)聚合有時(shí)會(huì)導(dǎo)致形成異常的組織結(jié)構(gòu)，結(jié)合生物支架有利于避免這一問題。例如，將肝外膽管細(xì)胞類器官種植在不同形狀的生物支架上可獲得類似于膽囊壁及肝外膽管的生物工程組織，且成功重建了膽囊受損小鼠的膽囊壁以及修復(fù)了小鼠的肝外膽管損傷。另外，結(jié)合三維器官芯片系統(tǒng)有望以一種易于獲得及可控的方式產(chǎn)生復(fù)雜的類器官模型，更好的服務(wù)于再生醫(yī)學(xué)。
4 展望
類器官作為處于體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn)交叉點(diǎn)的多功能模型，在疾病模型構(gòu)建、藥物篩選、細(xì)胞治療等方面具有很好的應(yīng)用前景。肝類器官在體外部分重現(xiàn)了肝臟發(fā)育的過程，可長(zhǎng)期維持細(xì)胞極性及來源個(gè)體的遺傳特性，移植入體內(nèi)后可迅速發(fā)育為成熟肝細(xì)胞，具有二維細(xì)胞培養(yǎng)及動(dòng)物模型無可比擬的優(yōu)勢(shì)。但目前肝類器官培養(yǎng)仍面臨許多挑戰(zhàn)，例如目前尚未對(duì)類器官培養(yǎng)所需凝膠系統(tǒng)matrigel進(jìn)行成分上的定義，當(dāng)引入培養(yǎng)體系時(shí)，可能會(huì)存在一些不可控的變異因素；肝類器官尚未包括肝臟中存在所有細(xì)胞類型，自然也無法完全實(shí)現(xiàn)成熟肝臟的功能，以及器官的血管化、免疫化及神經(jīng)支配。另一方面，其它有關(guān)離體肝細(xì)胞支持培養(yǎng)的研究也取得了重大進(jìn)展，例如應(yīng)用含有5種小分子化合物的培養(yǎng)基培養(yǎng)新鮮離體的人肝細(xì)胞，能夠長(zhǎng)期維持肝細(xì)胞的極性結(jié)構(gòu)、膜轉(zhuǎn)運(yùn)體表達(dá)和大部分成熟肝細(xì)胞功能。相信結(jié)合不斷發(fā)展的前沿科學(xué)技術(shù)，類器官可以早日精確再現(xiàn)器官的生發(fā)過程，成為良好的實(shí)驗(yàn)工具和臨床治療模型。
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