2013-04-15
周月
獼猴桃營養豐富,風味獨特,被譽為“水果之王”。'紅陽’獼猴桃果肉黃綠色,橫截面具放射狀血紅色條紋,含糖量高于其它獼猴桃品種,果汁鮮美,商品價值高。但獼猴桃屬雌雄異株植物,倍性復雜,雌雄株間花期不遇，致使種間雜交困難,育種周期長,具有不確定性。采用播種等常規繁殖方式容易造成品種退化,而利用組織培養方法可保持良種遺傳性狀和實現大量繁殖。近年來,國內主要對中華獼猴桃,國外主要對美味獼猴桃進行了組織培養研究,但繁殖效率普遍較低,且對紅陽獼猴桃的研究太少。因此,在獼猴桃育種中,迫切要求采用新的技術與手段改變其傳統育種現狀。同時,獼猴桃包括紅陽獼猴桃在生產栽培中易遭受病蟲害。在諸多病害中,潰瘍病最為突出,而傳統生產中農藥的使用會帶來很多副作用。植物基因工程技術為獼猴桃的抗病育種提供了一條新途徑。 本研究以紅陽獼猴桃莖段和葉片為外植體,通過莖段不定芽誘導與增殖和生根等培養基的篩選,通過葉片直接再生和不定芽增殖培養基的篩選以及良好根系的誘導形成建立了高頻再生體系,為紅陽獼猴桃的抗病基因工程育種奠定了良好基礎。通過影響轉化頻率的諸因素水平篩選,建立了遺傳轉化體系。經GUS染色和PCR分析,初步證明外源抗病基因LJAMP2已成功整合到紅陽獼猴桃基因組中。 主要研究結果如下： 1.莖段高效再生體系的建立。結果表明,最佳愈傷組織誘導培養基為MS+1.0mg·L-12,4-D+0.5mg·L-16-BA,莖段外植體培養30d，愈傷組織誘導率達100%：最佳愈傷組織增殖培養基為MS+2.0mg·L-12,4-D+0.4mg·L-16-BA,愈傷組織培養20d,1～4代平均增殖系數為3.38(倍)；最佳不定芽誘導培養基為MS+5.0mg·L-16-BA+0.1mg·L-1NAA,愈傷組織培養60d,不定芽誘導率達83.33%,每塊愈傷平均出芽數7.5個。最佳不定芽繼代培養基為MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,不定芽培養20d,1～6代平均繁殖系數達6.78；不定芽經0.01%IBA處理40min,在1/2MS培養基中20d生根率達100%,試管苗在含1/2MS液體培養基的珍珠巖中培養20d,根系發育良好。抽取85株試管苗移栽到田間營養缽中，15d后成活81株,成活率達95.29%。 2.葉片直接高效再生體系的建立。結果表明,最佳直接出芽培養基為MS+3.0mg·L-16-BA+1.0mg·L-1NAA,葉片外植體培養40d,不定芽誘導率達100%,平均出芽數18.67個/葉盤；在MS+2.0mg·L-1BA+1.0mg·L-1NAA+0.1mg·L-1GA3培養基中,30d增殖率達100%,1-6代不定芽平均繁殖系數達8.63；適宜壯苗培養基為MS+0.4mg·L-16-BA+0.2mg·L-1NAA,不定芽伸長生長迅速；伸長后的不定芽在含0.8mg·L-1IBA的1/2MS培養基中誘導生根15d后,在1/2MS基本培養基中培養15d(共生根30d),生根率達100%,根系發育良好。98株試管苗移栽到田間土營養缽中,30d成活95株,成活率達96.94%。 3.卡那霉素(Kan)選擇壓、抑菌抗生素及其濃度的確定。以葉片直接再生體系為實驗系統,研究了不同抗生素對外植體生長的影響。結果表明,不定芽分化受高濃度Kan抑制。培養基中不含Kan時,外植體分化正常；含15mg·L-1Kan時,葉片形成少量愈傷組織(愈傷形成率8.56%),但沒有不定芽分化;含20mg·L-1Kan時,愈傷組織形成和不定芽分化完全被抑制,外植體顏色逐漸變淺直至發白、死亡；含30mg·L-1Kan時,葉片完全褐化、死亡。因此,Kan選擇壓(臨界濃度)確定為20mg·L-1。100～500mg·L-1頭孢霉素(Cef)不能抑制農桿菌生長,400mg·L-1羧芐青霉素(Carb)能很好抑制農桿菌生長,且在最佳直接出芽培養基中,不定芽再生率達100%。因此,適宜的抑菌抗生素為Carb,其使用濃度為400mg·L-1。 4.影響轉化頻率的其它因素最佳水平的確定。以葉片為外植體,研究了影響轉化頻率的諸因素最佳水平。結果表明,諸因素的最佳水平分別為：預培養時間為3d、農桿菌浸染濃度為OD600=0.5,菌液中乙酸丁香酮(AS)含量為100μmol·L-1,浸染時間為10min,共培養為48h。 5.轉基因植株的獲得。采用根癌農桿菌介導法,轉化來源于益母草的陽離子抗菌肽基因LJAMP2。經Kanr篩選,共獲得40株Kanr植株,經GUS組織染色和PCR檢測,23株Kanr植株呈陽性,陽性植株達57.50%,證明外源基因LJAMP2已成功整合到紅陽獼猴桃基因組中。
機 構:
西南大學
領 域:
園藝；
關鍵詞:
'紅陽’獼猴桃； 葉片； 莖段； 再生；LJAMP2基因； 抗病；
