[ 作者：劉健，張玲菊，沈嵐，王芳，朱宏芬，張國芳，黃堅，嚴成其 轉(zhuǎn)貼自：本站原創(chuàng) 更新時間：2012-5-21 9:57:17 點擊數(shù)：747 ]
2012年第一期
摘要：以鐵皮石斛莖節(jié)段為外植體，研究不同濃度的外源激素配比對鐵皮石斛誘導和增殖的影響。實驗表明，不定芽誘導最佳誘導培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，最佳增殖培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂+10%椰子汁。
關鍵詞:鐵皮石斛;不空等;誘導;增值
鐵皮石斛（Dendrobium officinale）又名黑節(jié)草，屬氣生蘭科草本植物。其所含主要成分石斛多糖和石斛堿，具有滋陰、益胃、生津止渴、潤肺止咳、強壯及增強免疫活性的作用[4]，為南亞和東南亞地區(qū)著名的中草藥[5]。在我國主要分布于江西、廣西、廣東、貴州、云南、安徽、浙江、湖南、陜西、河南、福建等地[1-3]，多分布于海拔近千米的山地半陰濕巖石上，一般均能耐-5℃的低溫[4]。在野生狀態(tài)下，鐵皮石斛繁殖速率低下、生長緩慢，加之掠奪性采挖，使其野生資源日益減少，遠遠不能滿足國內(nèi)外市場經(jīng)濟發(fā)展和臨床醫(yī)學的需要，因此鐵皮石斛人工種植的規(guī)模迅速擴大[6-7]。常規(guī)條件下，鐵皮石斛人工繁殖較困難，組織培養(yǎng)技術在鐵皮石斛生產(chǎn)中得到廣泛應用。本實驗以鐵皮石斛莖段為外植體，并直接從莖段誘導叢生芽增殖，獲得大量的試管苗，建立了鐵皮石斛的快速繁殖體系，縮短了鐵皮石斛無性繁殖的周期，為進一步加快鐵皮石斛組織培養(yǎng)產(chǎn)業(yè)化發(fā)展奠定了技術基礎。
1 材料與方法
1.1實驗材料
供試材料鐵皮石斛外植體采自寧波市鹿亭鄉(xiāng)白鹿村。
1.2 外植體的消毒與培養(yǎng)
從鐵皮石斛植株上選擇新生健壯的莖段作為外植體，摘去葉片和膜質(zhì)葉鞘，剪取2cm長帶莖節(jié)的小段，用洗潔劑小心清洗后，置流水下沖洗10min備用。在超凈工作臺上用無菌水浸泡5min，75％的酒精消毒5s，0.1％HgCl滅菌5min后，再用無菌水沖洗數(shù)次，放入墊有干無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，以吸去多余水分。在莖段兩端各切去少許，保留莖節(jié)接入準備好的誘導培養(yǎng)基中，每瓶培養(yǎng)基插入10個莖節(jié)小段。經(jīng)一段時間的誘導，外植體膨大并產(chǎn)生原球莖，將誘導形成的原球莖轉(zhuǎn)移到增殖培養(yǎng)基中培養(yǎng)。選擇基本培養(yǎng)基均為1/2MS+7.5g/L瓊脂+30g/L蔗糖，pH 5.7～5.8。培養(yǎng)條件：溫度21~23℃，光強為2000Lx，光照時間12h/d。
1.3不定芽的誘導
以不同配比的激素：6-BA，萘乙酸（NAA），篩選出適合不定芽誘導的激素種類。莖段經(jīng)過消毒后，接種在誘導培養(yǎng)基中，每個處理20株，每3天觀察不定芽的誘導情況，比較誘導率與誘導時間，篩選出最適合的誘導培養(yǎng)基。
1.4不定芽的增殖
添加6-BA、NAA、椰子汁，選取大小一致的不定芽進行增殖培養(yǎng)，每3d觀察增殖情況。
2 試驗結(jié)果
2.1不定芽的誘導
本試驗將鐵皮石斛莖段外植體接種于1/2MS培養(yǎng)基附加不同濃度6-BA和NAA的培養(yǎng)基上，進行初代培養(yǎng)。外植體培養(yǎng)30d后的誘導結(jié)果見表1。結(jié)果表明，高濃度的NAA會抑制腋芽的萌發(fā)；6-BA在試驗中對腋芽誘導的作用表現(xiàn)為：隨著NAA濃度的增加，6-BA作用明顯；綜合考慮芽誘導率和健壯度等因素，處理8（1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）最適合腋芽誘導，此時腋芽的誘導率最高，芽健壯度也較好。
表1 不定芽的誘導
編號
6-BA
（mg/L）
NAA
（mg/L）
誘導倍數(shù)
誘導生長情況
0
0
0
1.0
正常
1
0.5
0.1
1.4
正常，愈傷組織少
2
0.5
0.2
1.2
正常，愈傷組織少
3
0.5
0.5
1.1
芽少，深綠色，有根
4
1.0
0.1
2.1
正常，
5
1.0
0.2
1.5
正常，芽飽滿，少量根
6
1.0
0.5
1.2
正常，有根
7
1.5
0.1
4.8
芽分化較多，芽細弱
8
1.5
0.2
3.8
正常，芽健康
9
1.5
0.5
2.3
正常，有根
10
2.0
0.1
6.2
不定芽畸形
11
2.0
0.2
4.3
不定芽畸形
12
2.0
0.5
2.9
不定芽玻璃化，畸形多
2.2不定芽的增殖
將誘導培養(yǎng)中大小一致的不定芽轉(zhuǎn)接至含不同濃度的6-BA和NAA的培養(yǎng)基中，濃度梯度同誘導試驗處理梯度。培養(yǎng)30d后，結(jié)果表現(xiàn)為，降低NAA與6-BA濃度，在處理5（1.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）的濃度配比下，增殖倍數(shù)為3.3，綜合觀察下不定芽生長狀況最好，并在后續(xù)的繼代培養(yǎng)中保持增殖倍數(shù)3倍以上。在增殖培養(yǎng)基上添加10%的椰子汁，鐵皮石斛增殖苗增值率有所提高，增殖倍數(shù)達4倍左右（表2）。
表2 不定芽的增殖
編號
6-BA
（mg/L）
NAA
（mg/L）
增殖倍數(shù)
生長情況
1
0.5
0.1
2.0
正常
2
0.5
0.2
1.5
正常
3
0.5
0.5
1.4
芽少，有根
4
1.0
0.1
3.3
正常
5
1.0
0.2
3.3
正常，芽飽滿
6
1.0
0.5
1.9
正常，有少量根
7
1.5
0.1
4.9
芽多，偏小
8
1.5
0.2
3.5
正常，芽多，成長緩慢
9
1.5
0.5
3.3
正常，有根
10
2.0
0.1
6.9
不定芽畸形
11
2.0
0.2
5.3
不定芽畸形
12
2.0
0.5
5.0
不定芽畸形
3 討論
本研究表明，在不定芽誘導試驗中，NAA在與6-BA搭配使用下，表現(xiàn)為低濃度的NAA促進鐵皮石斛腋芽萌發(fā)，誘導芽的分化；過高濃度NAA則會抑制腋芽的萌發(fā)，這與郭洪波[8]的研究結(jié)論相同。張治國等[9-10]研究了鐵皮石斛原球莖在VW、N6、1/2MS、B5、KC等6種培養(yǎng)基上的增殖和分化情況，結(jié)果表明，附加馬鈴薯提取液和植物激素后的6種基本培養(yǎng)基，原球莖均可分化，其中1/2MS是原球莖增殖和分化的最適宜培養(yǎng)基。我們的研究結(jié)果也與張治國等的研究結(jié)果一致：不定芽誘導的最佳誘導培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂，最佳增殖培養(yǎng)基配方是1/2MS+1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA +30g/L蔗糖+7.5g/L瓊脂+10%椰子汁。本試驗以莖段為外植體，具有易取材，繁殖系數(shù)高，繁殖速度快，周期短等優(yōu)點，在沒有種子的情況下利用莖段外植體同樣能快速生產(chǎn)鐵皮石斛植株。
參考文獻：
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