一、導(dǎo)讀
植物微生物群落結(jié)構(gòu)是代表植物健康和生長的關(guān)鍵決定因素之一。 然而，對于地上部與地下部群落之間及不同植物微環(huán)境中存在的細菌微生物結(jié)構(gòu)組成仍存在很多空白。在這項研究中，通過16s rRNA基因測序技術(shù)研究細菌菌群結(jié)構(gòu)，我們研究了楊樹不同生態(tài)位微生物群落的分化及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的假設(shè)。同時我們確定了胡楊不同生態(tài)位相關(guān)的核心細菌微生物群。這也為以后進一步研究菌群結(jié)構(gòu)提供理論依據(jù)。
二、論文ID
原名：Structural variability and niche differentiation in the rhizosphere and endosphere bacterial microbiome of field-grown poplar trees
譯名：野生楊樹的根際和內(nèi)生細菌微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)差異與生態(tài)位的不同
期刊：Microbiome
IF：8.496
發(fā)表時間：2017年
通信作者：Bram Beckers
通信作者單位：Centrefor Environmental Sciences, Hasselt University
三、實驗設(shè)計
四、實驗結(jié)果
第一條證據(jù)鏈
根際土壤樣本中找到的序列要多于植物部分。在根際部分我們鑒定出一小部分讀長屬于古生菌，根際土壤中有很大一部分不能被明確分類在門水平。在植物部分我們能夠區(qū)分出大部分讀長，只有一少部分不能進行區(qū)分。我們能夠?qū)Υ蟛糠肿x取數(shù)據(jù)進行分類，只有相對較小比例的讀取不分類。
表1 A：質(zhì)量控制前后的質(zhì)量指標，所有植物部分52個樣本計算的平均讀長。B：每個植物樣本指定讀長的平均數(shù)。通過單因素方差和比較檢驗方法統(tǒng)計分析顯著不同。95％置信區(qū)間的統(tǒng)計差異用小寫字母表示。C：比較在PCR擴增期間共擴增的非靶向16S rRNA序列（％）的數(shù)目。D：在門水平讀長不能明顯分類。對于每個植物部分進行單獨評估，數(shù)據(jù)代表根樣和根際土壤15個生物重復(fù)，以及根和葉內(nèi)生菌11個生物學獨立重復(fù)。
對各部分樣本進行稀釋性曲線的構(gòu)建，從圖中可以看出內(nèi)生細菌群落（b,c,d）對比根際群落含量較少。與根際樣品相比，內(nèi)生細菌樣品的稀釋性曲線形狀表現(xiàn)出更高程度的變化。評估每個樣品的OTU豐度的稀釋性曲線均接近飽和。根際土壤的稀釋性曲線開始變得平穩(wěn)，但更深入的測序可能會揭示更多的OTU。如稀疏曲線所描繪的，內(nèi)生部分OTU豐度的高度可變性可能由分散和非均勻定殖的胡楊根與植物的不同空間部分所導(dǎo)致。
圖1 每個植物部分的Good’s coverage平均值和稀釋曲線。Good’s coverage來代表15個獨立樣本的平均數(shù)。基于10000次迭代計算，Good’s coverage代表15個獨立楊樹樣本（根際土壤和根樣）和11個重復(fù)樣本（莖樣和葉樣）。小寫字母代表95％置信區(qū)間的統(tǒng)計學差異（P <0.05）。通過OTU數(shù)量的描繪稀釋曲線。豎直的虛線表示從每個樣本進行二次采樣以計算阿爾法多樣性估計的序列的數(shù)目。
根據(jù)OTU豐度、Simpson多樣性指數(shù)和Pielou’s均勻度，分析了每個樣品中的α多樣性，微生物多樣性。對于多樣性和均勻度計算，我們發(fā)現(xiàn)根際土壤樣品和內(nèi)生樣品之間存在明顯區(qū)別，根際土壤樣本對比植物其他部分表現(xiàn)出更高的多樣性和均勻度。在豐富度圖中，我們可以看出葉的豐富度指數(shù)與莖相同，根際土樣的豐度指數(shù)最高。
圖2 細菌群落結(jié)構(gòu)的Alpha多樣性分析。a.OTU豐度評估。b. Pielou’s均勻度評估。C.逆辛普森多樣性指數(shù)。對Alpha多樣性評估代表根際土壤和根的15個生物學重復(fù)樣本與莖和葉的11個重復(fù)樣本。
第二條證據(jù)鏈
為了比較不同植物部位鑒別的群落成分的組成，使用布雷柯蒂斯差異性來確定群落組成的主要因素。利用主成分分析顯示樣品中細菌群落結(jié)構(gòu)的所有相似性。A圖PCA分析顯示，根據(jù)不同植物部分的系統(tǒng)發(fā)生水平發(fā)現(xiàn)，細菌群落菌表現(xiàn)為強聚集。B圖分層聚類顯示植物部分可以根據(jù)土壤和根樣完全聚類。莖和葉樣品與根際土和根樣品能夠清楚地區(qū)分開來，但根際植物部分并沒有進行完全聚類。這表明在門水平和OTU水平上，各個植物部分令細菌微生物群存在差異。內(nèi)生菌群定殖和穩(wěn)定群落的形成似乎是一個更可變的過程。
圖3 在OTU水平植物各部分細菌菌群結(jié)構(gòu)組成。a 各個樣本的主成份分析，區(qū)分植物部分的OTUs在PCA圖上顯示為向量。b. 基于Bray-Curtis差異的樣本進行分層聚類。基于Bray-Curtis分析存在的相似性疊加到PCA圖上。
為了支持上述PCA分析結(jié)果，使用斯皮爾曼等級相關(guān)方法進行模擬單因素方差分析來檢測植物各部分存在的差異。在門水平和OTU水平上所有植物部分細菌微生物群落存在顯著差異。此結(jié)果與上圖一直起到支持PCA圖的作用，表明細菌群落在各個植物部分組成存在差異。
表2 利用Primer7斯皮爾曼等級相關(guān)方法模擬單因素方差分析分析植物部分對細菌群落結(jié)構(gòu)影響。顯著性等級*P ≤ 0.01; **P ≤ 0.001; ***P ≤ 0.0001。R，相似性分析測試數(shù)據(jù)。
第三條證據(jù)鏈
通過結(jié)構(gòu)圖可以看出，除了裝甲菌門、衣原體門、梭桿菌門和E型變形菌門以外，所鑒定的細菌門類均顯示出植物各部分特有的細菌門類豐度。對比植物其它部分在根際土樣中，檢測到放線菌門的顯著豐度達到27.19%是根際土樣中，δ-變形菌、酸桿菌門、芽單胞菌門、硝化菌屬和浮霉菌門均含量較少。α-變形桿菌在根際土樣中相比其他植物部分顯著減少。與根際土壤和葉樣品相比，TM7在根和莖樣品中顯著富集。特別是TM7，我們觀察到根和莖內(nèi)生細菌樣品之間的豐度變化很大。最后我們在莖樣中，我們觀察到異常球菌 - 棲熱菌門與其他植物相比含量較多。
圖4 OTUs物種分布圖。根際土樣與內(nèi)生根樣、莖樣、葉樣細菌門類相對豐度。變形桿菌OTU在亞類水平上已經(jīng)被5個OTU代替。主要存在的細菌門類以不同的顏色顯示，含量少的門類也被分組并顯示為灰色。β-變形菌在根際土壤和根樣中明顯富集，γ-變形菌在根際土樣和根樣的豐度較莖和葉樣品中減少。
第四條證據(jù)鏈
對于OTU數(shù)據(jù)，我們將核心細菌微生物組定義為每個植物部位中10個最豐富的OTU，最后產(chǎn)生了27個OTU。通過含量豐富的核心細菌對比發(fā)現(xiàn)；可以得出結(jié)論，莖和葉樣本的微生物群落盡管有不同OTU水平的菌種，但其中變形桿菌屬占主導(dǎo)地位，主要是α-變形菌和γ-變形菌屬。推測植物微生物群落特定細菌的富集和減少不是被動過程，而是取決于植物宿主對微生物的主動選擇，或者某些細菌只能在特定的生態(tài)位進行定殖。
圖5 植物生態(tài)位相關(guān)性最多OTU數(shù)細菌微生物組。分類樹狀圖展現(xiàn)了各個植物部分的主要細菌微生物。
為了支持OTU水平上的方差分析結(jié)果，進一步確定哪些OTU對觀察到的植物各部分之間的群落分化負責，我們使用物種指標分析法來計算OTU和植物隔室之間的顯著關(guān)聯(lián)性。在完整的矩陣上進行指標分析，而不僅僅是關(guān)注核心，還可以發(fā)現(xiàn)核心OTU分析可能遺漏的影響部分。當我們使用不包括平均相對豐度大于1％的OTUs的群落矩陣時，我們在根際土壤中發(fā)現(xiàn)了6個指標OTU，根樣中2個，莖樣中2個，葉樣中2個。
表3 用Dufrene-Legendre方法指示物種分析程序計算結(jié)果，并使用Benjamini-Hochberg方法的錯誤發(fā)現(xiàn)率對P值進行多重比較校正。顯著水平：*P ≤ 0.05; **P ≤ 0.01.
五、研究結(jié)論
結(jié)果發(fā)現(xiàn)田間種植的楊樹根際微生物組的結(jié)構(gòu)差異性遠低于內(nèi)生部分微生物。根際細菌群落的形成似乎是一個更穩(wěn)定和控制的過程，而根，莖和葉的內(nèi)生微生物定殖可變高，展示了內(nèi)生細菌對莖和葉的適應(yīng)和調(diào)整。并且確定了胡楊不同生態(tài)位相關(guān)的核心細菌微生物群。
六、點評
該研究確定了在胡楊中一個核心的細菌微生物在不同的生態(tài)位的變化。這可以為進一步研究胡楊與微生物之間的相互作用提供更加獨立、詳細的研究基礎(chǔ)。未來可以研究特定的宿主基因型效應(yīng)的分析，洞察細菌群落對宿主植物的具體變化。
本文由微生太殷繼忠編譯，殷繼忠、江舜堯編輯。
