摘要：Ruska和Knowll在1932年（有說是1931年和1933年的）研制成功第一臺電子顯微鏡。經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展，已廣泛應用到自然科學的許多學科中，并且極大推動了這些學科的發(fā)展。在七十年代電子顯微鏡終于實現(xiàn)了人們直接觀察原子的長期愿望，電子顯微鏡成了“科學之眼”。一門新興的電子顯微學因此而誕生。而Ruska也因此而獲得1986年諾貝爾物理獎。在生命科學，由于電子顯微鏡技術的迅速發(fā)展和應用，改變了細胞學、組織學、病毒學、分類學和分子生物學等的面貌，促使生物學從細胞水平進入到分子水平；它也成為生物學、醫(yī)學、農(nóng)林等學科研究工作中極為重要的手段。近年來，我國擁有越來越多的電子顯微鏡，應用也越廣泛，不少高等院校都相繼開設相關的課程。“科學之眼”不僅在外國，在我國也會越來越亮，開花結果，前途光明。
關鍵詞：電子顯微鏡 掃描電子顯微鏡 透射電子顯微鏡 掃描透射顯微鏡
正文：電子顯微鏡問世已有半個多世紀了，但其應用于醫(yī)學、生物學，尤其是細胞學的研究方面才只有二十余年的歷史。我國學者在六十年代初期開始這方面的工作。下面我們來看一下電子顯微鏡的總體發(fā)展歷程。
一．電子顯微鏡的總體發(fā)展歷程
人類對于生物微觀世界的認識過程，有著一段漫長的歷史。荷蘭人列文虎克(Leeuwenhoek)在300年前創(chuàng)制成功世界上第一架顯微鏡，發(fā)現(xiàn)了當時人們還不知道的微生物世界。這是顯微鏡第一次顯示其巨大作用。
早在一百年以前，樸率克(Plucker)就曾在蓋斯雷管的陰極近管壁上發(fā)現(xiàn)過一種黃綠色的光輝，但他當時對這一現(xiàn)象并無認識，未予重視。自從1924年德布羅意提出了電子與光一樣，具有波動性的假說和1926年Busch發(fā)現(xiàn)了旋轉(zhuǎn)對稱、不均勻的磁場可作為一個用于聚焦電子束的透鏡，就為后來的電子顯微鏡的問世奠定了理論基礎，這就打開了電子光學的大門。經(jīng)六年后，到1932年克諾露(Knoll)及魯斯卡(Ruska)等人首次發(fā)表了關于電子顯微鏡的實驗和理論研究，并試制成功第一臺電磁式電子顯微鏡。為了獲得較大的放大能力，人們又研究制造了短焦距的電磁透鏡，它除了會聚透鏡外，再利用兩個透鏡作連續(xù)兩次的造像。到1934年魯斯卡和馬頓(Marton)分別制成了新型復式電子顯微鏡。近代的電磁式電子顯微鏡在具體結構上已經(jīng)有了很大改進。
Ruska和Knowll在1932年（有說是1931年和1933年的）研制成功第一臺電子顯微鏡。經(jīng)過半個多世紀的發(fā)展，已廣泛應用到自然科學的許多學科中，并且極大推動了這些學科的發(fā)展。在七十年代電子顯微鏡終于實現(xiàn)了人們直接觀察原子的長期愿望，電子顯微鏡成了“科學之眼”。一門新興的電子顯微學因此而誕生。而Ruska也因此而獲得1986年諾貝爾物理獎。在生命科學，由于電子顯微鏡技術的迅速發(fā)展和應用，改變了細胞學、組織學、病毒學、分類學和分子生物學等的面貌，促使生物學從細胞水平進入到分子水平；它也成為生物學、醫(yī)學、農(nóng)林等學科研究工作中極為重要的手段。近年來，我國擁有越來越多的電子顯微鏡，應用也越廣泛，不少高等院校都相繼開設相關的課程。“科學之眼”不僅在外國，在我國也會越來越亮，開花結果，前途光明。
如果說，光學顯微鏡是人類對微觀世界的認識有了第一次飛躍，那么可以說，電子顯微鏡是人類對微觀世界的認識有了第二次飛躍。的確，光學顯微鏡使人類看到了肉眼看不到的細菌和細胞，揭開了許多生物界的“謎”，但是因為光學顯微鏡的分辨率受光波波長的限制，使更多的“謎”仍無法解開。而電子顯微鏡是以電子束作為光源的，電子束的波長比可見光的波長短得多，使電子顯微鏡的分辨率大幅度提高。從此，人類用電子顯微鏡揭示了細菌、噬菌體、類病毒、DNA和蛋白質(zhì)大分子等，甚至獲取了“原子核和電子云”的原子像。
總體歷程了解后，下面我們來關注一下透射電子顯微鏡的發(fā)展歷程：
二．透射電子顯微鏡的發(fā)展歷程
1924年，德國科學家德布羅意(De Broglie)指出，任何一種接近光速運動的粒子都具有波動本質(zhì)。1926---1927年，Davisson和Germer以及Thompson Reid用電子衍射現(xiàn)象驗證了電子的波動性，發(fā)現(xiàn)電子波長比X光還要短，從而聯(lián)想到可用電子射線代替可見光照明樣品來制作電子顯微鏡，以克服光波長在分辨率上的局限性。1926年德國學者Busch指出“具有軸對稱的磁場對電子束起著透鏡的作用，有可能使電子束聚焦成像”，為電子顯微鏡的制作提供了理論依據(jù)。
1931年，德國學者諾爾(Knoll)和魯斯卡(Ruska)獲得了放大12～17倍的電子光學系統(tǒng)中的光闌的像，證明可用電子束和電磁透鏡得到電子像，但是這一裝置還不是真正的電子顯微鏡，因為它沒有樣品臺。1931—1933年間，魯斯卡等對以上裝置進行了改進，做出了世界上第一臺透射電子顯微鏡（簡稱透射電鏡）。1934年，電子顯微鏡的分辨率已達到500?，魯斯卡也因此獲得了1986年的諾貝爾物理學獎。
1939年德國西門子公司造出了世界第一臺商品透射電子顯微鏡，分辨率優(yōu)于100?.1954年又產(chǎn)生了著名的西門子ElmiskopⅠ型電子顯微鏡，分辨率優(yōu)于10?.在英國，透射電子顯微鏡的研究始于1935年，1946年設計了第一批商業(yè)透射電子顯微鏡，導致了EM型電鏡的系列生產(chǎn)。在荷蘭，1944年研制成第一臺電鏡，后來生產(chǎn)了著名的Philips EM和CM型透射電子顯微鏡。我國的透射電子顯微鏡研制始于20世紀50年代，1977年已作出了分辨率為3?的80萬倍的透射電鏡。
目前世界上生產(chǎn)透射電鏡的主要是這三家電鏡制造商：日本的日本電子(JEOL)和日立(Hitachi)以及美國的FEI（這家公司把荷蘭的菲利浦電鏡公司收購了）。他們生產(chǎn)的透射電鏡大致可分為三類。
（1） 常規(guī)的TEM：加速電壓為100～200kV。代表性產(chǎn)品有日本電子的JEM-2010，日立的H-8000，菲利浦的CM200，F(xiàn)EI的TECNAI20.200kV透射電鏡的分辨率可達1.9?.
（2） 中壓TEM：加速電壓為300～400kV。代表性產(chǎn)品有日本電子的JEM-3010、JEM-4000，日立的H-9500，F(xiàn)EI的TECNAIF30。300kV透射電鏡的分辨率可達1.7?，400kV透射電鏡的分辨率可達1.63?.
（3） 高壓TEM：加速電壓為1000kV。代表性產(chǎn)品有JEM-1000，日立公司還制造了世界上最大的3000kV的透射電鏡。目前1000kV的透射電鏡最高分辨率可達1?.
目前用的最多的透射電鏡是200kV和300kV的電鏡，高壓電鏡由于價格昂貴，體積龐大，用得很少。
1949年以前，由于很難制備出能讓電子束穿過的薄金屬樣品，開始用透射電鏡直接觀察試樣。隨后，荷蘭的Bollnan和英國劍橋大學的赫什(Peter B.Hirsch)研究組進一步發(fā)展這一技術。特別是Hirsch研究組，發(fā)展了電子衍襯理論，可以解悉電子束穿過試樣形成的電子衍襯像，開創(chuàng)了用透射電鏡直接觀察試樣的時代，為電子顯微鏡在材料學的應用打下了基礎。
20世紀70年代，美國亞利桑那州立大學的考利(JohnCowley)和澳大利亞墨爾本大學的穆迪(Alex Moodie)建立了高分辨電子顯微想的理論與技術，發(fā)展了高分辨電子顯微學。20世紀80年代，發(fā)展了高空間分辨分析電子顯微學，人們可采用高分辨技術、微衍射、電子能量損失譜、電子能譜儀等對很小范圍內(nèi)（約1nm）的區(qū)域進行電子像、晶體結構、化學成分的研究，將電子顯微分析技術在材料學中的研究大大地拓展了。20世紀90年代，由于納米科技的飛速發(fā)展，對電子顯微分析技術的要求越來越高，進一步推動了電子顯微學的發(fā)展。目前，透射電鏡已發(fā)展到了球差校正透射電鏡的階段。
早在1935年，Knoll在設計透射電子顯微鏡的同時，就提出了掃描電子顯微鏡的原理及設計思想。下面我們來關注一下掃描電子顯微鏡的發(fā)展歷程。
三．掃描電子顯微鏡的發(fā)展歷程
如果說光學顯微鏡處于“老年”、透射電鏡處于“壯年”時代的話，那么掃描電鏡是剛進入“青少年”的時代。
掃描電子顯微鏡(scanning electron microscope,簡稱掃描電鏡/SEM)的基本組成是透鏡系統(tǒng)、電子槍系統(tǒng)、電子收集系統(tǒng)和觀察記錄系統(tǒng)，以及相關的電子系統(tǒng)。現(xiàn)在工人掃描電鏡的概念最早是由德國的Knoll在1935年提出來的，1938年Von Ardenne在透射電鏡上加了個掃描線圈做出了掃描透射顯微鏡（STEM）。第一臺能觀察厚樣品的掃描電鏡是Zworykin制作的，它的分辨率為50nm左右。英國劍橋大學的Oatley和他的學生McMullan也制作了他們的第一臺掃描電鏡，到1952年他們的掃描電鏡的分辨率達到了50nm。到1955年掃描電鏡的研究才取得較顯著的突破，成像質(zhì)量有明顯提高，并在1959年制成了第一臺分辨率為10nm的掃描電鏡。第一臺商業(yè)制造的掃描電鏡是Cambridge ScientificInstruments公司在1965年制造的MarkⅠ“Steroscan”。Crewe將場發(fā)射電子槍用于掃描電鏡，使得分辨率大大提高。1978年做出了第一臺具有可變氣壓的商業(yè)制造的掃描電鏡，到1987年樣品腔的氣壓已可達到2700 Pa(20 Torr)。目前掃描電鏡的發(fā)展方向是采用場發(fā)射槍的高分辨掃描電鏡和可變氣壓的環(huán)境掃描電鏡（也稱可變壓掃描電鏡）。目前的高分辨掃描電鏡可以達到1～2 nm，目前，最好的高分辨掃描電鏡可在氣壓為4000 Pa（30 Torr）時仍保持2nm的分辨率。
由于掃描電鏡的景深遠比光學顯微鏡大，可以用它進行顯微斷口分析，且樣品不必復制，可直接觀察，非常方便。另外，掃描電鏡的樣品室的空間很大，可以裝入很多探測器。因此，目前的掃描電鏡已不僅僅是只用于形貌觀察，它可以與許多其他分析儀器組合在一起，是人們能在一臺儀器中進行形貌、微區(qū)成分和晶體結構等多種微觀組織結構信息的同時分析，如果再采用可變氣壓樣品腔，還可以在掃描電鏡下做加熱、冷卻、加氣、加液等各種實驗，掃描電鏡的功能大大擴展。這也是為什么掃描電鏡得到如此普遍應用的原因之一。
下面我們來對比一下掃描電鏡與光學顯微鏡和透射電鏡的特點：看是什么優(yōu)點使掃描電子顯微鏡應用如此廣泛：
（1） 景深大、圖像富有立體感。掃描電鏡的景深較光學顯微鏡大幾百倍，比透射電鏡大幾十倍。由于掃描電鏡是利用電子束轟擊樣品后所悉放的二次電子成象，它的有效景深不受樣品的大小與厚度的影響；而透射電鏡是利用穿透電子成象，它的有效景深直接受樣品厚度的限制。
（2） 圖像的放大范圍大、分辨率也比較高。光學顯微鏡的有效放大倍數(shù)為一千倍左右，透射電鏡的放大倍數(shù)為幾百倍到一百萬倍，掃描電鏡可放大十幾倍到幾十萬倍，它基本上包括了從放大鏡、光學顯微鏡直到透射電鏡的放大范圍。掃描電鏡的分辨率介于光學顯微鏡（2000?）與透射電鏡（2—3?）之間，可達60?（有的可達30?），而且，一旦聚焦好了之后，可以任意改變放大倍數(shù)而不需要重新聚焦。
（3） 樣品制備過程簡單，不需進行超薄切片，有的甚至不需要進行任何處理就可以直接觀察。
（4） 觀察樣品的尺寸可大至120×80×，而透射電鏡的樣品只能裝在直徑或的銅網(wǎng)上。
（5） 樣品可以在樣品室中做三度空間的平移和旋轉(zhuǎn)，因此，可以從各種角度對樣品進行觀察，有的甚至可以在觀察過程中對樣品進行顯微解剖。
（6） 電子束對樣品的損傷與污染程度很少。掃描電鏡中打在樣品上的電子束流很小，電子束的直徑為50?至幾百?，束的能量較小（加速電壓可小至2千伏），電子束不是固定照射在樣品的某一區(qū)域而是以點的形式在樣品表面做光柵狀掃描，因此，由電子書照射所引起的樣品的損失與污染也較小。
（7） 在觀察形貌的同時，還可利用從樣品發(fā)出的其他信號作微區(qū)成分分析或進行晶體學分析。
（8） 掃描電鏡顯示的圖像有立體感，使人似如親臨微觀世界的現(xiàn)場。
（9） 安裝X射線能譜儀（EDS、WDS）到掃描電鏡上面可以同時快速、有效獲取同一區(qū)域上的形貌、晶型和組成信息。
由于掃描電鏡具有上述這些特點，因此，它不僅在許多重要學科的科學研究中而且在工農(nóng)業(yè)生產(chǎn)部門也得到廣泛的應用。
掃描電子顯微鏡了解完后，我們看一下由透射電子顯微鏡與掃描電子顯微鏡結合產(chǎn)生的掃描透射電子顯微鏡（STEM）的發(fā)展歷程：
四．掃描透射電子顯微鏡（STEM）的發(fā)展歷程：
許多年以來，掃描電子顯微鏡（SEM）就已經(jīng)是生物學工作者熟悉的一種有價值的工具，它的分辨率比光學顯微鏡高40多倍，而在高倍時的焦深遠大于光學顯微鏡（可高達幾千倍）。人們用它已經(jīng)積累起大量的有關表面精細結構的有價值的資料。因為掃描式顯微鏡中，當纖細的聚焦束以光柵方式掃描整個物體時，像便按時間順序逐點的建立，分辨率主要取決于聚焦束的最小尺寸實際上探針電流必須大于10ˉ，如果采用平常的加熱式鎢絲源，分辨率被限制在5 nm左右。自從普通的透射電子顯微鏡（TEM）能達到的分辨率比掃描電子顯微鏡搞一個數(shù)量級以來，直至最近還沒怎么打算構建掃描透射電子顯微鏡（STEM）。盡管知道用場發(fā)射陰極做電子光源的亮度高一萬到一百萬倍還不久，然而早已就嘗試（大約20年前）（Grewe,Wall和Langmore,1970;Crewe和Wall,1970）。當前市售的STEM商品儀器的分辨率優(yōu)于0.5 nm。
知道掃描透射電子顯微鏡是什么會時候，我們再看一下它在行家眼里的定位和發(fā)展前景：
就STEM儀器的價格昂貴而言，這首先意味著要對一些語言及早期結果作出評價還為時過早，看來這是一個緩慢的過程。其次，STEM怎么說也不會像TEM或SEM那樣普及。然而，有人預期STEM將在未來顯微術的某幾個方面做出相當大的貢獻。首要的是在透過生物厚樣品（多至0.5um甚至1um）方面，STEM的分辨率會大大超過有相同加速電壓的TEM。雖然在這方面的性能似不能與1Mev的高壓電子顯微鏡（HVEM）相媲美，但是STEM比HVEM的價格低廉，尺寸較小，而且操作和維護都大大簡易，因此人們實際上會選上它。第二，在超薄切片或單個大分子的高分辨率顯微術領域中，STEM的極限分辨本領雖不會超過TEM，然而在像的亮度、不受旋轉(zhuǎn)影響、亮場像易于解悉以及儀器和樣品的不穩(wěn)定性對像記錄的影響均較少等諸方面都有優(yōu)越性。第三，STEM的暗場成像方式比TEM有效得多，因此在不染色的生物分子成像時具有較高的反差。第四，易于進行信號處理，這指的是容易采用像Z識別技術，譬如可見到生物分子中標記的單個重金屬原子。第五，STEM還有清潔的超高真空，使污染大為減少，并能縮小輻射損傷，這個優(yōu)點在未來的高分辨率研究生物分子時是一個日益重要的特征。也可能，STEM的最大長處是在于它進行顯微分析的潛力。電子衍射、X射線能量分散顯微分析和電子能量損失光譜學都能順利的在同一臺儀器上進行。不論哪種型式的STEM，其優(yōu)點都比TEM多。所以，STEM在一般的生物研究中雖然不會使TEM淘汰，然而我們深信，在行家云集之處，STEM將對生物科學做出較大的貢獻。
下面我們對上述內(nèi)容做一總結及對電鏡做一個展望：
五．總結及展望
電子顯微鏡是在1931年，由德國科學家EnestRuska 和 Max K –noll 首先發(fā)明的。雖然他們的第一臺用電子束和電磁透鏡組成的顯微鏡只將銅網(wǎng)放大了12倍，但是卻揭開了用電子顯微鏡探索微觀世界的新篇章。1986年，世界上第一臺透射電鏡的發(fā)明者E.Ruska與發(fā)明掃描隧道顯微鏡的科學家G.Binning和H.Rohrer 一起榮獲諾貝爾物理獎。幾十年來電子顯微鏡技術不斷發(fā)展的歷程，終于使人們確認了第一臺電鏡問世的重要作用，被譽為“本世紀最主要的發(fā)明之一”。
自世界上第一臺電鏡問世至今，電鏡技術持續(xù)不斷地發(fā)展了半個多世紀，無論在深度還是在廣度上都取得了長足的進步。電鏡無愧為“科學之眼”，為人類發(fā)現(xiàn)微觀世界的奧秘和解悉生命現(xiàn)象的本質(zhì)做出了貢獻，成為發(fā)展現(xiàn)代生命科學的有利工具之一。
幾十年來，儀器更新的速度十分驚人，例如：第一臺電鏡的放大倍數(shù)只有12倍，而現(xiàn)在電鏡已可以連續(xù)把樣品放大到百萬倍。電鏡的進步主要表現(xiàn)在分辨力的提高和功能的增加上，電鏡的最佳晶格分辨力已達0.1 nm，點分辨力已達0.2～0.3nm。電鏡的種類和功能也不斷的增加，除了能揭示超薄切片和冷凍復性樣品的超微結構的透射電鏡外，又相繼出現(xiàn)了能解釋樣品表面超微結構的掃描電鏡；能同時觀察樣品的表面和內(nèi)部的超微結構，甚至能觀察單個原子像的高分辨力（小于0.1nm）的場發(fā)射槍掃描透射電鏡；能對樣品中的某些化學元素進行綜合分析（定性、定位、半定量和定量，靈敏度達10ˉ）的分析電鏡；以及能觀察活細胞的超高壓（500kV～3000kV）電鏡等。
總之，電子顯微鏡以其高分辨本領和科學的直觀性顯示出無比的魅力，在眾多領域，如：生物、醫(yī)學、農(nóng)林、養(yǎng)殖和材料科學研究方面得到了廣泛的應用，發(fā)揮著不可忽視的作用。展望電鏡技術的未來更是前景廣闊。
電鏡技術的應用與未來前景無比廣闊，有許多新知識等待著人們?nèi)ヌ骄浚性S多方法等待著人們?nèi)?chuàng)造，有許多新問題等待著人們?nèi)ソ鉀Q。長江后浪推前浪，總有一代新人會在電子顯微術的領域里努力探索，創(chuàng)造出更美好的未來。
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