我按照前面的流程轉錄組差異表達分析小實戰（一），將小鼠的4個樣本又重新跑了一遍，從而獲得一個新的count文件：mouse_all_count.txt，有需要的話，可以下載下來進行后續的差異分析。
一般來說，由于普遍認為高通量的read count符合泊松分布，所以一些差異分析的R包都是基于負二項式分布模型的，比如DESeq、DESeq2和edgeR等，所以這3個R包從整體上來說是類似的（但各自標準化算法是不一樣的）。
當然還有一個常用的R包則是Limma包，其中的limma-trend和limma-voom都能用來處理RNA-Seq數據（但對應適用的情況不一樣）
下面準備適用DESeq2和edgeR兩個R包分別對小鼠的count數據進行差異表達分析，然后取兩者的結果的交集的基因作為差異表達基因。
DEseq2
library(DESeq2)##數據預處理database <- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = "\t", header = T, row.names = 1)database <- round(as.matrix(database))##設置分組信息并構建dds對象condition <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)), levels = c("control", "Akap95"))coldata <- data.frame(row.names = colnames(database), condition)dds <- DESeqDataSetFromMatrix(countData=database, colData=coldata, design=~condition)dds <- dds[ rowSums(counts(dds)) > 1, ]##使用DESeq函數估計離散度，然后差異分析獲得res對象dds <- DESeq(dds)res <- results(dds)#最后設定閾值，篩選差異基因，導出數據(全部數據。包括標準化后的count數)res <- res[order(res$padj),]diff_gene <- subset(res, padj < 0.05 & (log2FoldChange > 1 | log2FoldChange < -1))diff_gene_DESeq2 <- row.names(diff_gene)resdata <- merge(as.data.frame(res), as.data.frame(counts(dds, normalized=TRUE)),by="row.names",sort=FALSE)write.csv(resdata,file = "control_vs_Akap95.csv",row.names = F)最終獲得572個差異基因（篩選標準為padj < 0.05, |log2FoldChange| > 1）
edgeR
library(edgeR)##跟DESeq2一樣，導入數據，預處理（用了cpm函數）exprSet<- read.table(file = "mouse_all_count.txt", sep = "\t", header = TRUE, row.names = 1, stringsAsFactors = FALSE)group_list <- factor(c(rep("control",2),rep("Akap95",2)))exprSet <- exprSet[rowSums(cpm(exprSet) > 1) >= 2,]##設置分組信息，并做TMM標準化exprSet <- DGEList(counts = exprSet, group = group_list)exprSet <- calcNormFactors(exprSet)##使用qCML（quantile-adjusted conditional maximum likelihood）估計離散度（只針對單因素實驗設計）exprSet <- estimateCommonDisp(exprSet)exprSet <- estimateTagwiseDisp(exprSet)##尋找差異gene(這里的exactTest函數還是基于qCML并且只針對單因素實驗設計)，然后按照閾值進行篩選即可et <- exactTest(exprSet)tTag <- topTags(et, n=nrow(exprSet))diff_gene_edgeR <- subset(tTag$table, FDR < 0.05 & (logFC > 1 | logFC < -1))diff_gene_edgeR <- row.names(diff_gene_edgeR)write.csv(tTag$table,file = "control_vs_Akap95_edgeR.csv")最終獲得688個差異基因（篩選標準為FDR < 0.05, |log2FC| > 1）
取DESeq2和edgeR兩者結果的交集
diff_gene <- diff_gene_DESeq2[diff_gene_DESeq2 %in% diff_gene_edgeR]最終的差異基因數目為545個
head(diff_gene)[1] "ENSMUSG00000003309.14" "ENSMUSG00000046323.8" "ENSMUSG00000001123.15"[4] "ENSMUSG00000023906.2" "ENSMUSG00000044279.15" "ENSMUSG00000018569.12"其他兩個R包（DESeq和limma）就不在這嘗試了，我之前做過對于這4個R包的簡單使用筆記，可以參考下：
簡單使用DESeq做差異分析
簡單使用DESeq2/EdgeR做差異分析
簡單使用limma做差異分析
以前一直沒有機會用Y叔寫的clusterProfiler包，這次正好看說明用一下。
GO富集，加載clusterProfiler包和org.Mm.eg.db包（小鼠嘛），然后將ENSEMBL ID后面的版本號去掉，不然后面不識別這個ID，然后按照clusterProfiler包的教程說明使用函數即可。
library(clusterProfiler)library(org.Mm.eg.db)##去除ID的版本號diff_gene_ENSEMBL <- unlist(lapply(diff_gene, function(x){strsplit(x, "\\.")[[1]][1]}))##GOid mapping + GO富集ego <- enrichGO(gene = diff_gene_ENSEMBL, OrgDb = org.Mm.eg.db, keytype = "ENSEMBL", ont = "BP", pAdjustMethod = "BH", pvalueCutoff = 0.01, qvalueCutoff = 0.05)##查看富集結果數據enrich_go <- as.data.frame(ego)##作圖barplot(ego, showCategory=10)dotplot(ego)enrichMap(ego)plotGOgraph(ego)KEGG富集，首先需要將ENSEMBL ID轉化為ENTREZ ID，然后使用ENTREZ ID作為kegg id，從而通過enrichKEGG函數從online KEGG上抓取信息，并做富集
library(clusterProfiler)library(org.Mm.eg.db)##ID轉化ids <- bitr(diff_gene_ENSEMBL, fromType = "ENSEMBL", toType = "ENTREZID", OrgDb = "org.Mm.eg.db")kk <- enrichKEGG(gene = ids[,2], organism = "mmu", keyType = "kegg", pvalueCutoff = 0.05, pAdjustMethod = "BH", qvalueCutoff = 0.1)##查看富集結果數據enrich_kegg <- as.data.frame(kk)##作圖dotplot(kk)到這里為止，轉錄組的差異表達分析算是做完了，簡單的來說，這個過程就是將reads mapping 到reference上，然后計數獲得count數，然后做差異分析，最后來個GO KEGG，over了。。。
對于mapping和計數這兩部還有其實還有好多軟件，具體可見文獻：Gaining comprehensive biological insight into the transcriptome by performing a broad-spectrum RNA-seq analysis，有時間可以都嘗試下。
至于GO && KEGG這兩步，對于人、小鼠等模式物種來說，不考慮方便因素來說，完全可以自己寫腳本來完成，數據可以從gene ontology官網下載，然后就是GO id與gene id相互轉化了。KEGG 也是一樣，也可以用腳本去KEGG網站上自行抓取，先知道URL規則，然后爬數據即可。
