我們來看cell上這篇文章，和昨天介紹的FANTOM項目研究目的和方法幾乎一樣。
通過這篇文章我們來看下他們是如何研究增強子表達和腫瘤之間的作用機制的~
FANTOM5項目研發出了一種捕獲技術，當DNA開始轉錄合成RNA時，就能夠立馬捕獲RNA，從而精確地定位啟動子。這項技術也能夠定位增強子，因為這些調控DNA也會被轉錄為RNA。
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每個細胞組分的生物學功能都是由如“俄羅斯套娃”樣的多級基因調控層次控制的，包括轉錄因子-啟動子互作、增強子激活、DNA甲基化、microRNA介導的調控、翻譯和翻譯后修飾。在癌細胞中，調控網絡常常被共同導致癌癥表型的分子畸變重構。例如，體細胞突變可以修飾調控網絡中反式和順式元件的功能，從而賦予與腫瘤發生相關的細胞行為。大型患者隊列TCGA研究系統地表征了各種癌癥類型的不同水平的關鍵分子改變，為致癌機制和潛在治療方法提供了前所未有的見解。
重構癌癥調控網絡遠未完成，尤其是增強子部分。增強子是重要的非編碼DNA元件，其與它們的靶啟動子在空間上相互作用以調控下游基因。作為主要的細胞發育調控元件，增強子在致癌過程中也發揮關鍵作用。目前，仍缺乏癌癥細胞全局的活性增強子表達分析，這可能是由于大樣本量高通量測序（如chip-seq）技術上的難度造成的。
為什么用RNA-seq檢測增強子表達：非活性增強子通常由未修飾的核小體組成，因此不能被轉錄因子或聚合酶接觸（接近）。當增強子被激活以響應信號傳導時，其局部染色質首先被修飾（通常由H3K4Me1修飾）并變得松散，使得增強子可被轉錄因子和RNA聚合酶接觸。當結合的轉錄因子完全激活增強子時，通常被H3K27Ac重新標記，局部染色質完全開放，募集RNA聚合酶在兩個方向啟動轉錄。因此，增強子表達水平代表增強子活化的基本特征，可以通過RNA-seq檢測大部分增強子的表達。
增強子活化過程
注：CAGE-seq（cap analysis of gene expression），結合mRNA加帽位點鑒定和高通量測序的手段，可以高通量地鑒定整個細胞內mRNA的轉錄起始位點，從而獲得準確的啟動子信息和5’UTR信息。
（1）描述癌癥中增強子表達的全局模式；
（2）了解增強子激活與其它基因組畸變以及相關基礎機制的關系；
（3）鑒定定關鍵增強子并探索其潛在的臨床意義。
路線
增強子篩選及表達分析流程
來自33種癌癥的8,928個癌癥樣本TCGA RNA-seq表達數據，共計鑒定到15,808個增強子。每種癌癥類型>10％樣本平均檢測到4,591種增強子。在25種具有足夠樣本量以及隨訪時間的癌癥類型中，通過Cox回歸分析與疾病生存期相關的活性增強子，結果表明許多活性表達的增強子與預后相關。肝臟肝細胞癌（LIHC）具有最低的增強子表達水平（?100RPM），而胸腺瘤（THYM）增強子表達水平最高（?240RPM）。與相同患者的正常組織相比，大多數癌癥類型的腫瘤組織的增強子表達水平升高，即增強子活化。
不同癌癥中表達的活性增強子及與預后相關的活性增強子
不同癌癥活性增強子的表達水平以及與正常對照樣本間的比較
體細胞拷貝數改變（Somatic copy-number alteration, SCNA）和點突變是2種影響癌癥基因組穩定性的最常見的突變。結合來自Affymetrix SNP6.0的非整倍體數據（SCNA）以及全外顯子組測序得到沉默（silent）體細胞突變（不引起氨基酸替換）數據（TMB，突變負荷/載量），與增強子活化數據（RPM）聯合分析，表明大多數癌癥類型（19/25）中非整倍體水平與增強子活化水平呈顯著正相關。相反，沉默點突變則沒有相關性或只有輕微的負相關性。
SCNA / silent TMB vs. 增強子表達水平RPM
注：橙色或藍色表示相關系數Spearman’s correlation coefficient (rho)檢驗為顯著的。
對腫瘤樣本的1500個增強子表達數據進行consensus聚類分析，得到3種亞類（簇）：C1、C2和C3，并且不受疾病類型驅動。3種亞類的腫瘤樣本增強子表達水平均高于其正常樣本，其中C2亞類的增強子表達水平最高。如前所述，SCNA與增強子表達水平正相關，故而C2亞類中受SCNA的影響比較大，SCNA影響數千基因表達。對于silent體細胞突變負荷TMB，C1>C2>C3。增強子激活與基因組不穩定性的相關性可以概括為下圖：C1亞類富含具有高突變負荷和低非整倍性的樣品；C2亞類富含具有較高突變負荷和高非整倍性的樣品；C3為“normallike”，接近于正常組織，具有低突變負荷和低非整倍性。癌癥類型內和癌癥類型間的分析都表明SCNAs是與增強子激活正相關的突變形式，而不是silent點突變。
根據增強子表達數據對腫瘤樣本進行consensus聚類分析 不同亞類間的增強子表達水平、SCNA和silent突變負荷比較
為什么SCNAs和點突變與癌癥中的增強子激活相關聯？據報道，人類基因組染色質空間組織的變化是整個基因組體細胞突變率變化的主要決定因素。低突變率是開放染色質DNA的一個特征，因為突變可通過DNA修復機制獲得修復；同時，染色質開放恰好是增強子活化的先決條件。激活后，增強子與目標DNA成環，并與其互作，產生DNA-DNA拓撲結構上的互作；當發生斷裂時，遠程DNA-DNA物理上接觸增加了部分1D-序列相距很遠的位點接觸和發生重排的機率，由此產生結構變異——這揭示了SCNAs和點突變分別與增強子激活間差異相關性的分子機制，是建立在染色質開放性差異的基礎上。在該模型中，緊湊染色質有利于點突變并保持增強子沉默；一旦染色質打開，增強子被激活的可能性增加。同時，由于展開的DNA被拉長了1-2個數量級，所以遠程DNA-DNA互作發生的可能性增加，同時增加了DNA重排（SCNA）的機會。ATAC-seq和H3K27ac的ChIP-seq數據標識開放染色質（open chromatin），用H3K9me2和H3K9me3標識封閉染色質（closed chromatin），開放和封閉染色質的雙鏈斷裂（DSB，SCNA斷裂點）率和點突變率的確呈現相反趨勢。
以“染色質狀態”為中心的模型
根據上述模型，開放染色質中的遠程DNA-DNA互作（Hi-C互作），至少在一定程度上解釋了增強子激活和不同基因組區域中SCNAs的正相關性。為了測試這種可能性，作者檢測了人基因組的雙鏈斷裂（DSB）率最高的500個10-kb片段，發現40％（n = 204）富集于Hi-C鑒定到的Loop區域。同時，增強子也傾向與loop區域重疊。下圖提供了一個簡單而合理的假設模型，雖然僅試驗性地解釋了增強子激活與SCNAs和突變的差異關聯。
開放染色質促進DNA結構重排的假設模型
整合增強子和mRNA表達數據，通過共表達分析可獲得增強子的候選靶基因。對于共表達的特定增強子-基因組合，至少存在3種可能的關系模型：（1）因果關系，增強子表達的變化引起基因的差異表達；（2）reactive關系，基因位于增強子的上游；（3）共響應關系，增強子和基因都響應其它分子變化。本文中以第一種關系進行探討，引入eQTL進行分析?；驹砣缦拢河绊懺鰪娮踊钚缘膯魏塑账岫鄳B性（SNP）會影響增強子下游靶基因的表達，由此使得SNP（或鄰近連鎖遺傳的SNP）成為目標基因的eQTL位點；對于這樣的共表達增強子-基因對，使用Hi-C數據來評估該因果關系是否為直接調控。
共表達增強子與基因之間的關系模型以及鑒定具有因果關系的增強子-基因互作的流程
根據該方法，鑒定了65個符合條件的互作，涉及49個增強子和47個癌癥基因，并繪制了預測的增強子-基因調控網絡。其中22個和8個癌癥基因分別注釋為CGC數據庫中的癌基因（oncogene）和腫瘤抑制基因（TSG），表明增強子更傾向于調控癌基因。根據CGC注釋，這30個基因位于不同的癌癥hallmarks基因集中，富集于增殖和轉移。這些增強子-基因共表達富集于直接調控和因果調控?？傊@些結果提供了增強子激活可能有助于腫瘤發展的途徑的見解。
增強子-基因共表達網絡
增強子作為預后標志物：作者以chr22（chr22：50980817-50981280，下文簡稱增強子22）和其推斷的目標基因SYK為例，詳細分析了增強子如何調控驅動基因從而作為預后標志物。ENCODE ChIP-seq數據集注釋到增強子22區域內或其側翼富集大量蛋白質-DNA互作peak。3個連鎖遺傳的SNP位于增強子22中，這3個SNP都是SYK基因的eQTL（基因型與mRNA或者蛋白表達水平相關）。SYK是一種致癌驅動基因，在多種類型的晚期癌癥中被激活，并且與臨床預后不良相關?；颊呱鏁r間分析進一步支持了增強子22作為幾種癌癥類型的不良預后的標志物。由于eQTL、RNA-seq和蛋白質數據是從獨立平臺生成的，并且在多個來源組織中觀察到相關性，所以這些結果提供了增強子22是預后標志物的證據，主要通過對其下游基因SYK的調控作用實現。
不同癌癥中增強子22的K-M生存曲線分析
增強子作為免疫治療反應的預測標志物：PD-L1在癌癥免于免疫系統攻擊中扮演著重要角色，因此一直是免疫治療“檢查點抑制”的主要靶標，尤其是肺癌和黑色素瘤的治療，下面以距PD-L1約140kb的增強子（chr9：5580709-5581016，下文稱為增強子9）為例進行闡述。作者發現多種癌癥類型中觀察到PD-L1 mRNA和增強子9之間的強共表達；在CCLE（癌癥細胞系百科全書數據庫）130個肺癌細胞系中也證實了增強子9與PD-L1共表達；PD-L1 eQTL位于增強子的鄰近區域，表明增強子是PD-L1的上游調控元件；人類細胞系的Hi-C數據集進一步證實了PD-L1基因和增強子9之間的直接相互作用。ENCODE項目中調查的161個轉錄因子中，NF-kB是唯一注釋到增強子9的一個轉錄因子；ChIP-seq數據顯示NF-kB強烈結合在增強子9上以及PD-L1啟動子的p65結合基序上，表明NF-kB參與增強子/ PD-L1相互作用。同時，最近有研究報道，NF-kB二聚體對于PD-L1的激活是必不可少的。利用CRISPR-Cas9敲除增強子9，獲得穩定的增強子9純合缺失的肺癌A549細胞系。增強子9的敲除在mRNA和蛋白質水平都顯著降低PDL1表達，掩蓋了IFN-g（活化的NF-kB）誘導PD-L1表達的效應。這些結果表明，NF-kB介導的增強子-啟動子相互作用的PD-L1活化模型，強調了增強子調節關鍵治療靶點的潛在重要方式。
增強子9調控免疫治療靶點PD-L1表達
