單細胞測序作為時下火熱的測序技術(shù)，吸引了越來越多的科研人員。作為臨床醫(yī)生，掌握著豐富的人類樣本，對于單細胞測序技術(shù)無疑是錦上添花。但許多臨床工作者擔心沒有科研思路，不知道該如何進行實驗。小編今天就用一篇文章來梳理單細胞測序思路，以供參考。
下面這篇文章是北醫(yī)三院喬杰院士在2018年10月所發(fā)的人類睪丸單細胞測序工作。題目是“Single-Cell RNA SequencingAnalysis Reveals Sequential Cell Fate Transition during Human Spermatogenesis”。
首先作者得到成人睪丸樣本，保留了2,854個細胞用于隨后的scRNA-seq分析。所有細胞利用tSNE可視化，展示了所有睪丸細胞類型并進行聚類。共分出連續(xù)的14個細胞群和獨立的3個細胞群。接下來是精子發(fā)生時期所表達的不同表面Marker，用來展示不同位置的細胞群所處的精子發(fā)生時期，并定義細胞類型。
對于已經(jīng)定義的14個生殖細胞的細胞群進行偽時序分析，可以得到細胞發(fā)育先后關(guān)系的順序結(jié)果。因為不同的生殖細胞有著不同的增殖速率，所以作者將生殖細胞群中的細胞周期基因表達情況用熱圖展示，結(jié)果表明了在SSC中細胞增殖狀態(tài)相對不活躍，在分化型精原細胞中，G1 / S和G2 / M期基因都是活躍的，之后逐漸退出細胞周期形成精子。與此相比睪丸體細胞幾乎靜止并且顯示較低的增殖活性。同時作者還分析出不同時期細胞中特異性基因表達模式，隨后使用免疫熒光對其進行了生物學驗證。
接著作者利用之前分析的tSNE數(shù)據(jù)細化出3種精原細胞的亞群，先對這3種亞群進行差異基因的熱圖可視化，對這些差異基因進行GO分析。得到了不同差異基因所參與的生物學功能，如分析出簇1基因主要參與“細胞生物合成過程的負調(diào)節(jié)”等。之后將在3群中富集到的已知的Marker利用免疫熒光來對睪丸染色，驗證所分析的細胞亞群是真正的新的亞群。
之后作者對精母細胞，精子細胞，睪丸體細胞也做了相似的數(shù)據(jù)分析以及生物學驗證。
要想將文章發(fā)表于高水平雜志，那么光靠單細胞測序是不夠的。如果能將文章上升到具有臨床意義的高度，那就最好了。所以作者將臨床中NOA患者的睪丸做HE染色鑒定，表明不可育，隨后進行單細胞測序，并對其體細胞進行驗證。分析了正常睪丸體細胞相比的差異表達基因并作出火山圖將其可視化。對差異基因進行GO分析，可以得到NOA患者表達上調(diào)的差異基因所參與的生物學功能。
在實驗的最后，作者利用MGI數(shù)據(jù)庫和本次單細胞分析數(shù)據(jù)，對比了人與小鼠之間的基因，并表明精子發(fā)生相關(guān)事件在人和小鼠之間是保守的。同時利用OMIM數(shù)據(jù)庫篩選出了51個男性不育和NOA相關(guān)基因，這些基因之前在人類中被鑒定出來。這些疾病相關(guān)基因中有49個是人鼠同源差異基因。這些結(jié)果表明在小鼠中使用基因消融來研究人類男性不育。
所以可以看出單細胞測序文章的最基本方法就是tSNE聚類，偽時序分析，差異基因分析，GO富集，最后用免疫熒光做驗證。
