文章轉載自公眾號：circRNA
8月30日，Molecular Cell雜志在線發表了斯坦福大學Howard Y. Chang團隊的一篇circRNA研究論文，報道外源circRNA激活自身免疫效應通路的新證據，細胞通過識別是否攜帶m6A修飾來識別內源和外源circRNA[1]。
早在2017年，Howard Y. Chang就曾經在Molecular Cell雜志報道細胞可以通過RIG-I識別細胞內生成的circRNA（內源circRNA）和體外合成環化的circRNA（外源circRNA），RIG-I識別外源circRNA后可激活自身免疫效應通路[2]。（推薦閱讀：Molecular Cell:細胞識別內源/外源circRNA的機制）。然而，就在2019年3月份，Molecular Cell雜志發表了麻省理工學院Daniel G. Anderson教授的文章，報道外源合成的circRNA轉染細胞后并不引起免疫效應通路，他們認為Howard Y. Chang早期的這篇文章是由于樣品純度不夠，可能是其中摻雜的帶5’磷酸基的線性RNA引起的非特異性效應[3]。（推薦閱讀：環化的RNA不誘發免疫反應，且可以高效翻譯蛋白）。
關于外源circRNA是否可以激活細胞自身免疫效應通路的問題，Howard Y. Chang教授和Daniel G. Anderson教授的觀點幾乎完全相反，Howard Y. Chang教授認為可以但Daniel G. Anderson教授認為不能。本文中，作者還是堅持外源circRNA能夠引發自身免疫效應的觀點，那么作者是如何證明他們的體系是嚴謹可靠的？如何證明外源circRNA能夠引起自身免疫效應？m6A修飾如何讓內源circRNA避免激活免疫效應通路的？下面就讓我們一起看看作者是如何證明他們的觀點的：
如何證明他們的體系是嚴謹可靠的？
Howard Y. Chang教授和Daniel G. Anderson教授得出不同結論，但都是基于他們的實驗證據而得出的，Howard Y. Chang教授要證明自己的觀點就必須給出更有說服力的證據。文中作者針對實驗體系的問題專門做了詳細的說明，概括而言包括以下幾個方面：
（1）樣品純度問題：樣品純度問題是兩個團隊得出不同結論的一個焦點，Daniel G. Anderson教授認為Howard Y. Chang教授發表文章中外源circRNA的樣品中摻雜了少量帶5’磷酸基的線性RNA產物（[3]）。對此，本文中作者給出了相應的說明，Daniel G. Anderson教授在發表的文章中用RNase R消化了30分鐘，沒有用堿性磷酸酶（AP）處理。但本文及2017年那篇文章中作者用RNase R消化了超過兩個小時，并且后面也用了AP酶進一步的處理。作者還比較了AP和RNase R處理后純化的外源circRNA（circFOREIGN）與含有線性RNA但經過兩次AP酶處理的樣品對細胞的影響，兩組樣品對細胞的刺激作用是相當的。但純的線性RNA經過兩次AP酶處理后，對細胞的刺激作用則顯著減弱。
（2）實驗體系：純化方法也是他們有差別的地方。Howard Y. Chang教授采用的是凝膠純化，Daniel G. Anderson教授則通過高效液相色譜（HPLC）。會不會是因為純化體系的差別導致的？對此，本文也給出了相應的解釋和分析。作者首先比較了RNase R與AP酶處理前后的樣品分別經過凝膠電泳回收后的產物對細胞的作用情況，發現經過凝膠回收的circFOREIGN都具有刺激自身免疫效應通路的能力，也就是說不管是否經過RNase R和AP酶處理，凝膠回收的產物的效應是一樣的。作者也嘗試了HPLC純化的方法，但所得的峰形與Daniel G. Anderson教授報道的不太一致，可能是由于使用的設備和體系差別所致。HPLC分離的RNase R處理的circFOREIGN樣品能得到兩個峰，對應于膠回收中的兩個條帶。純化得到的circFOREIGN依然能夠激活免疫通路。HPLC純化過程中發現在circFOREIGN峰的前面有一個小分子產物的峰，主要成分是一些RNase R降解不徹底的片段或者內含子成分，但貫穿全過程的AP酶處理已經抑制了這些分子的免疫原性。作者還認為HPLC純化的方法不如膠回收的效果好，因為HPLC處理過程會產生更多的小片段產物。
如何證明外源circRNA能夠引起自身免疫效應？
circFOREIGN在體外細胞中激活免疫效應通路已經在2017年的文章中做了充分的工作。本文著重分析circFOREIGN在小鼠體內的作用情況。如果circFOREIGN在體內也能激活自身免疫效應通路，那么它有沒有可能具有疫苗佐劑的功能呢？為驗證這一假設，作者設計實驗，在小鼠中注射雞卵清蛋白（OVA，可模擬疫苗接種過程）。分別用Poly（I:C），單獨circFOREIGN和PEI包裝后的circFOREIGN，分析接種后血液中T細胞和抗體的變化情況。結果表明，circFOREIGN或PEI包裝后的circFOREIGN均能與Poly（I:C）起到相似的作用，可以促進機體免疫效應。說明circFOREIGN在體內可以發揮疫苗佐劑的功能。表達OVA的B16細胞構建皮下腫瘤模型，然后通過接種OVA和circFOREIGN，分析circFOREIGN存在是否能抑制腫瘤的生長并延長小鼠壽命。結果顯示，同時注射circFOREIGN可以有效促進注射OVA所激發的體內免疫效應，提高腫瘤免疫效應能力，進而抑制腫瘤生長，延長小鼠的生存。
圖1 circFOREIGN可以作為疫苗佐劑 （[1]）
為探索細胞識別內源和外源circRNA的機制，作者設計實驗進行ChIRP分析，找出各個組別相互作用的蛋白分子。設計了三個組進行實驗：circFOREIGN即為上述體外純化的circRNA分子，代表外源circRNA分子；circZKSCAN1由ZKSCAN1基因的內含子形成，是內源的circRNA分子；circSELF是將circFOREIGN的序列（GFP序列）克隆到circZKSCAN1的側翼序列中，模擬circZKSCAN1的形成過程生成內源的circZKSCAN1分子，作者稱之為circSELF。ChIRP結果表明內源的circZKSCAN1和circSELF均可以結合m6A的“Writer”和“Reader”分子，但不結合“Eraser”分子。m6A-irCLIP分析表明外源和內源circRNA分子的m6A修飾狀態有非常大的差別，circSELF在靠近接口位置的3’位置有明顯的m6A修飾區域，但circFOREIGN沒有m6A的修飾。
圖2 內源circRNA分子結合m6A“Writer”和
“Reader”分子 （[1]）
m6A修飾如何讓內源circRNA避免激活免疫
效應通路的？
外源和內源circRNA的m6A修飾存在明顯差異，那么細胞是否是通過m6A修飾來識別出它們是外源還是內源的circRNA呢？為了證明這個問題，作者分別從體外和體內設計實驗進行分析：體外合成circFOREIGN的時候通過將A堿基完全置換為m6A修飾的（100% m6A circFOREIGN），僅有1%的A堿基置換為m6A的（1% m6A circFOREIGN）以及沒有m6A的circFOREIGN，處理細胞后分析免疫相關通路的變化，結果表明100% m6A circFOREIGN沒有影響相關基因的表達，1% m6A circFOREIGN有明顯的激活作用，但弱于circFOREIGN。1% m6A circFOREIGN在小鼠體內的佐劑功能也大大減弱。為分析內源circRNA修飾狀態的影響，作者設計過表達circFOREIGN（GFP序列）和突變體進行分析，設計將GFP序列中RRACH序列突變為RRUCH（circFOREIGN ΔRRACH），或者將序列中所有的A均突變為U（A-less circ-FOREIGN）。QPCR檢測免疫相關通路基因的表達情況，結果表明circ-FOREIGN細胞內表達不會引起免疫效應，但circFOREIGN ΔRRACH能夠較大程度刺激相關基因的表達（約100倍），而A-less circ-FOREIGN則更明顯的刺激相關基因表達（約10000倍）。
圖3 m6A修飾影響circFOREIGN免疫原性 （[1]）
YTHDF2是常見的m6A識別蛋白（Reader），且定位在胞質中，因此作者提出YTHDF2可能在m6A介導的內源circRNA不激活免疫效應方面發揮作用的假設。在YTHDF2-KO的Hela細胞中，攜帶不同比例m6A修飾的外源circRNA均能激活免疫相關基因表達，而回補表達YTHDF2后，細胞恢復識別內源/外源circRNA的功能。此外，作者還在細胞中構建了YTHDF2與circRNA強制結合的模型，YTHDF2基因融合λN肽，circRNA序列增加BoxB 序列元件（不帶A堿基的突變體？），細胞中兩者可以通過λN肽與BoxB的特異性結合使得YTHDF2強制與circRNA相互作用，在YTHDF2野生型和KO細胞中分別表達和共表達兩種質粒，分析下游免疫效應通路的變化。結果表明，野生型細胞中單獨表達circFOREIGN-BoxB可以顯著促進免疫效應的激活，但共表達YTHDF2-λN后不再激活免疫效應基因。
圖4 m6A修飾的circRNA通過結合YTHDF2避免激活免疫效應的通路 （[1]）
METTL3是常見的RNA m6A的修飾酶，但METTL3敲除或干擾會導致細胞死亡。但作者發現如果在METTL3敲除的同時能抑制RIG-I，細胞就不會發生死亡。體外實驗表明外源circRNA并不能激活RIG-I的纖維化聚合和活化，但5’-磷酸基的雙鏈RNA可以。這說明外源circRNA并不是通過直接激活RIG-I誘導下游基因的變化的。
RIG-I的活化還有另外一種機制，即通過K-63多聚泛素化結合RIG-I的CARD結構域，促進RIG-I的聚合狀態。RIG-I激活后會誘導MAVS的聚合。分析表明細胞經過circFOREIGN處理后能顯著促進MAVS的聚合纖維化，但1% m6A和100% m6A則減弱這一效應。circFOREIGN處理后也會誘導IRF3的二聚化，1% m6A和100% m6A則減弱這一效應。
圖5 RIG-I介導circFOREIGN誘導的免疫效應通路 （[1]）
細胞內共定位分析結果表明外源的circFOREIGN和YTHDF2，RIG-I，K63-Ubn共定位，但當circFOREIGN中有10%的m6A修飾后，circFOREIGN單獨與RIG-I共定位的比例會明顯下降，而circFOREIGN，RIG-I和YTHDF2共定位的比例明顯增多。說明YTHDF2可以在m6A的介導下與RIG-I/K63-Ubn/circRNA復合體相互作用。
圖6 共定位分析 （[1]）
總之，本文的機制可以概括為如下示意圖：外源circRNA（不攜帶m6A修飾）可以通過與K63-Ubn和RIG-I結合并促進RIG-I聚合和激活，進而促進下游MAVS的聚合進而誘導IRF3的二聚化激活，最終誘導自身免疫相關通路基因的表達。細胞內源產生的circRNA由于攜帶m6A修飾，募集并結合了YTHDF2，后者抑制了RIG-I/K63-Ubn/circRNA復合體的活化，最終不會誘發自身免疫效應通路激活。
圖7 外源circRNA誘導自身免疫效應激活的機制 （[1]）
參考文獻：
1. Y. Grace Chen, R.C., Sadeem Ahmad, Rohit Verma, Sudhir Pai Kasturi, Laura Amaya, James P. Broughton, Jeewon Kim, Cristhian Cadena, Bali Pulendran, Sun Hur and Howard Y. Chang, N6-Methyladenosine Modification Controls Circular RNA Immunity. Molecular Cell, 2019.
2. Chen, Y.G., et al., Sensing Self and Foreign Circular RNAs by Intron Identity. Mol Cell, 2017. 67(2): p. 228-238 e5.
3. Wesselhoeft, R.A., et al., RNA Circularization Diminishes Immunogenicity and Can Extend Translation Duration In Vivo. Mol Cell, 2019. 74(3): p. 508-520 e4.
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