原位激活心肌細胞（CM）增殖是用于在心臟損傷或疾病（例如心肌梗塞MI和心力衰竭）之后替代丟失或凋亡的CM的有前景的方法。非編碼RNA（ncRNA）在細胞周期調控中起著至關重要的作用，有可能促進CM的增殖。環狀RNA（circRNA）是一類新的ncRNA，通過將RNA的3'末端連接到5'末端而環化。circRNA環狀結構保持其穩定性并增強其與miRNA或者蛋白的結合能力。因此，circRNA可能比非環狀RNA在調節心臟再生和誘導CM增殖方面更有效。此外，新證據表明circRNA可控制細胞增殖，分化，發育甚至組織再生。 CircRNA還參與心血管系統的生理和病理過程，包括心肌病的發展，CM肥大，衰老和細胞凋亡。最近高通量RNA測序揭示了新生兒和成人心臟之間經常差異表達的circRNAs，這些失調的circRNA可能參與心臟再生。因此，由于circRNA在細胞增殖和CM功能中的重要作用,靶向circRNAs可能是促進心臟再生的新策略。
在遺傳學中，超級增強子（SEs）是哺乳動物基因組的區域，其包含多個增強子，其由一系列轉錄因子蛋白共同結合以驅動參與細胞身份的基因的轉錄。由于超級增強子經常在對控制和定義細胞身份重要的基因附近被識別，因此它們可用于快速鑒定調節細胞身份的關鍵基因。包含超級增強子的增強子共享增強子的功能，包括結合轉錄因子蛋白，環化靶基因和激活轉錄。在超級增強子（例如CDK7，BRD4）處觀察到高水平的許多轉錄因子和輔因子。
來自南方醫科大學南方醫院心血管內科的賓建平教授研究團隊最近在Circulation（IF=18.881）期刊上在線發表了題為“Loss of Super-Enhancer-Regulated CircRNA Nfix Induces Cardiac Regeneration After Myocardial Infarction in Adult Mice”的研究，通過整合RNA測序大數據和超級增強子（SEs）目錄，鑒定了與調節心臟再生有關的circRNA—circNfix。轉錄因子Meis1結合circNifx 基因座的SE，增強circNifx的表達；circNifx表達下調可以促進心肌細胞的增殖和血管生成，而抑制心肌梗死后心肌細胞的凋亡，從而改善心肌功能和預后。機制上，circNfix增強Ybx1與Nedd41的結合，誘導Ybx1的泛素化降解，抑制cyclin A2和cyclin B1表達；另一方面circNfix可以海綿miR-214，促進其靶基因Gsk3β的表達，而抑制β-catenin的活性。該研究為改善心肌梗死后心肌功能和預后提供了新的靶點和治療策略。
1. circNifx是心臟SE相關的circRNA，在成年小鼠心肌細胞中富集表達
RNA測序揭示了新生兒和成年心臟之間差異表達的circRNAs，但是從眾多候選circRNAs篩選出對于心臟再生所必需的circRNAs是非常困難的。超級增強子（SEs）是一大群的活性增強子簇，其富集用于關鍵轉錄因子的結合。這些增強子簇是發育時期和細胞類型特異性的，通過調控細胞身份基因或ncRNA表達來影響細胞分化和發育。超級增強子經常在對控制和定義細胞身份重要的基因附近被識別，因此它們可用于快速鑒定調節細胞身份的關鍵基因。重要的是，已發現SE相關的ncRNA可促進心臟發生和CM分化，這兩者都是CM增殖過程中的關鍵環節。作者假設SE很可能標記控制CM分化和發育的circRNA，從而幫助鑒定調節心臟再生的關鍵circRNA。根據H3K27ac標記的存在來定義，由23種人體組織中產生的增強子目錄，每種增強子對應circRNAs的最近端啟動子。各種circRNAs與SEs在空間上相關，被命名為SE-circRNAs。 SEs可標記表達豐富、組織表達特異性和發育時期特異的circRNAs。
通過對新生和成年大鼠心臟的circRNA表達譜數據，篩選出在人、小鼠和大鼠中序列相對保守的circRNAs，接著利用SEs篩選出心臟發育時期特異表達的SE相關的circRNAs。CircRNA_Nfix 和circRNA_Slc8a1是主要的發育時期差異表達的候選circRNA。作者發現circRNA_Nfix在心肌細胞CMs中的表達量明顯高于circRNA_Slc8a1的。而相比于新生小鼠心臟和CMs，Nfix mRNA表達水平在成年小鼠心臟和CMs明顯升高。RT-PCR、RNase R和放線菌素D處理證明circNfix的環狀結構和穩定性。circNfix序列在人、小鼠和大鼠之間的保守性高達95%。circNfix在小鼠多種組織均有表達，尤其在心臟中豐富表達；相比于心臟其他類型細胞，circNfix在CMs中明顯高表達；從小鼠新生到成年的心臟發育過程，circNfix在CMs中的表達水平逐漸上調。新生小鼠（P0）經誘導心肌梗死7天后，可在梗死的邊緣區域，觀察到circNfix表達水平下調，而心肌細胞增殖活躍；8周成年小鼠（P56）經誘導心肌梗死7天后，觀察到circNfix的表達水平上調，而心肌細胞增殖不活躍。RNA FISH實驗證明circNfix主要定位于P7小鼠心肌細胞胞漿中表達。
2. circNfix表達下調可促進體外CM的增殖
利用siRNA敲低circNfix表達，顯著地增加P7 小鼠心肌細胞周期活性標志物（Ki67、EdU、pH3、Aurora）的表達和心肌細胞去分化標志物（Nkx2.5、a-SMA、RUNX1和DAB2）的表達，流式結果也證明敲低circNfix表達導致P7 CM細胞阻滯在S和G2/M期，而且促進P7 小鼠心肌細胞的分裂；circNfix過表達則抑制P0 心肌細胞的增殖。
3. circNfix表達下調可促進體內CMs的增殖
體內利用AAV病毒敲低circNfix表達14天后，IF染色心臟發現，敲低circNfix表達顯著性提高心臟中增殖的CMs的比例和總的CMs數目，促進RUNX1蛋白的表達，提示下調circNfix表達可誘導CM的去分化和再分化后的增殖。向心臟注射了AAV9-shcircNfix后分離CMs后體外培養，發現總的CM數目和pH3+或者 Ki67+ CMs比例也明顯增加。
4. 在心肌梗死后circNfix表達下調可促進成年小鼠的心臟再生
為了評估在心肌梗死發生時，circNfix表達下調對心肌修復和心肌功能的維持的影響，作者構建心肌梗死模型后在梗死外周區域注射AAV9-shcircNfix 或者 AAV9-shNC，敲低circNfix表達會明顯增加梗死邊界區域的增殖性CMs的比例，明顯降低凋亡性CMs的數目，增加IB4+, CD31+ 或者 vWF陽性血管的密度，提示敲低circNfix表達可誘導心臟再生的過程。
circNfix表達下調對于心肌功能修復的影響：超聲波心動描記術揭示circNfix表達下調可以維持而不降低射血分數EF和左室短軸縮短率FS。PET/CT, TTC染色和Masson trichrome 染色揭示circNfix表達下調可以明顯減少心臟梗死面積和纖維化的程度。而且circNfix表達下調組小鼠的生存率明顯高于shNC組小鼠的。
5. 過表達circNfix可抑制新生小鼠CM的增殖
體內利用ADV病毒過表達circNfix 4天后，IF染色心臟發現，過表達circNfix可顯著性減少心臟中增殖的CMs的比例和總的CMs數目，增加梗死邊界區域的TUNEL+CMs的比例，抑制IB4, α-SMA 或者 CD31陽性血管的密度，抑制心肌梗死后心臟的血管再生，明顯降低心臟射血分數EF，增加心肌梗死面積，提示在新生小鼠模型中過表達circNfix可抑制心肌細胞的增殖，抑制心臟再生修復的功能。
6. Meis1通過結合Nfix基因座上的SE，調控circNfix的表達
在人和小鼠心臟中存在與Nfix基因座結合的超級增強子SEs。ChIP-seq數據分析，發現該SE結合區域還存在其他SE標志修飾，如H3K4me1, H3K27me3, P300 和DNase Hypersensitive Site (DHS)。在成年心臟中circNfix的表達水平增加，伴隨著在Nfix基因座上的活性組蛋白標志修飾增加，而失活性組蛋白標志修飾減少。Meis1的ChIP-seq profile揭示Meis1峰值與circNfix相關的SE有重疊，而且該重疊區域序列在不同種屬間高度保守(A-C)；circNfix-SE分為E1, E2, E3, E4，分別被克隆在enhancer-reporter載體后在CM中檢測其活性，發現E2增強子被高度活化(D)。EMSA和ChIP-qPCR實驗進一步證明Meis1與 E2的結合作用(F-G)。沉默Meis1 表達明顯抑制circNfix的表達，而促進Nfix mRNA的表達(H-I)。沉默Meis1 表達可促進CMs的增殖，而過表達circNfix則抵消這個效應（J）,這些結果提示Meis1與 circNfix_SE的相互作用緊密地調控circNfix的表達水平。
7. circNfix促進Ybx1 的泛素化降解
biotin標記探針捕獲circNfix后，質譜分析沉淀物，鑒定出富集最多的蛋白就是Ybx1。WB和RIP實驗證明了circNfix與Ybx1的結合作用（A-B）；敲低circNfix表達顯著性抑制Ybx1蛋白的表達，不抑制 Ybx1 mRNA的表達，而MG132處理可以抑制Ybx1蛋白水平的降低（C-D），提示Ybx1蛋白有可能經泛素蛋白酶體途徑降解；circNfix過表達促進Ybx1蛋白移位到胞漿，并促進其降解（G）。敲低或過表達circNfix 分別可以減少或者增加Ybx1的泛素化。質譜分析結果發現E3泛素連接酶Nedd4l有可能參與Ybx1的泛素化降解。Protein docking program預測和Co-IP證明了Ybx1和Nedd4l的相互結合。RNA pulldown和 RIP實驗則證明了circNfix與Nedd4l的相互結合作用。circNfix的表達不會影響到Nedd4l的表達，而會影響到Ybx1 與 Nedd4l的相互作用（J）。沉默Nedd4l的表達增加Ybx1蛋白的穩定性，抵消了circNfix過表達后降低Ybx1蛋白的效應（K-L）。
據報道，核Ybx1可結合cyclin A2 和cyclin B1的啟動子，并活化其轉錄。為進一步驗證，敲低Ybx1表達可顯著性降低cyclin A2 和cyclin B1蛋白水平，抵消了敲低circNfix表達導致cyclin A2 和cyclin B1蛋白水平升高的效應（H）；ChIP-qPCR實驗也證明了Ybx1與cyclin A2 和cyclin B1啟動子的相互結合作用（I）；沉默Ybx1表達可抵消沉默circNfix表達后誘導CM增殖的效應。以上結果提示，circNfix通過促進Ybx1 的泛素化降解，抑制CM的增殖。
8. CircNfix 可以海綿miR-214，調節CM的增殖能力
經生信分析預測，兩種miR-214和761與CircNfix有著最多的相互結合位點，其中miR-214在心肌中的表達水平更高，而且CircNfix表達下調可以顯著性上調miR-214的表達，接著luciferase reporter, RNA pulldown和 RNA FISH實驗證明了miR-214 與 circNfix的相互結合作用。
通過過表達miR-214，作者分析對miR-214下游可能的靶基因，篩選到與心臟再生有關的靶基因—Gsk3β， miR-214與 Gsk3β 3’UTR的結合位點在種屬間高度保守。Luciferase reporter和 RNA FISH體外實驗證明了miR-214 與 Gsk3β的相互作用， CircNfix過表達提高其熒光素酶活性，而miR-214過表達則抑制其活性。
在心臟中敲低CircNfix表達可顯著性抑制Gsk3β的表達，而miR-214抑制劑則抵消該抑制效應。MiR-214 mimics抑制，而miR-214 抑制劑促進Gsk3β的表達。據報道，Gsk3β通過降解β-catenin而調節 CM的增殖。與此一致的是，敲低CircNfix表達可以顯著性抑制β-catenin的表達；Meis1表達下調顯著性抑制Gsk3β的表達，而過表達CircNfix則逆轉該抑制效應。抑制miR-214表達會抵消circNfix或Gsk3β表達下調促進CM增殖的效應。無論是否同時還是單獨抑制Ybx1或 miR-214表達，都會抵消circNfix表達下調促進CM增殖的效應。總之，作者圍繞著Meis1/circNfix/miR-214/Gsk3β/β-cateninh和circNfix/Ybx1/ cyclin A2和cyclin B1兩條調節通路進行正反向的功能驗證，說明這兩條通路對于調控CM增殖的有效性。
參考文獻
1. Huang S, Li X, Zheng H, et al. Loss of Super-Enhancer-Regulated CircRNA Nfix Induces Cardiac Regeneration After Myocardial Infarction in Adult Mice. Circulation. 2019 Apr 5. doi: 10.1161/CIRCULATIONAHA.118.038361.
