----新加麻黃附子細辛湯對小鼠Lewis原位肺癌的治療作用
姚靜靜，杜振華，李自波，杜鋼軍河南大學藥學院 藥物研究所
摘 要: 〔目的〕觀察新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis 原位肺癌是否有治療作用。〔方法〕Lewis 肺癌細胞滴氣管建立小鼠 Lewis 原位肺癌模型，次日用新加麻黃附子細辛湯(麻黃∶細辛∶附子∶半夏 = 1∶ 2∶2∶ 5) 灌胃開始治療， 觀察各組小鼠的生存狀態、腫瘤數目及致瘤率;HE 染色法觀察肺病理變化。〔結果〕用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立的 Lewis 原位肺癌模型 8 周后致瘤率為 91% ，腫瘤數目平均為 17 ± 3． 05;新加麻黃附子細辛湯在相同時間內致瘤率為 69% ，腫瘤數目平均為 12 ± 1． 53。HE 染色結果表明:正常組小鼠肺部切片未見癌細胞;模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現明顯癌變，細胞核與細胞質比例失常，細胞核密集， 空洞逐漸變小;新加麻黃附子細辛湯組細胞核密集區相對較少。與模型組比較，新加麻黃附子細辛湯組體質量明顯上升， 攝水食量增加， 自主活動增多， 精神狀態良好。〔結論〕新加麻黃附子細辛湯能夠延長 Lewis 原位肺癌模型小鼠的生存時間，對小鼠 Lewis 原位肺癌具有治療作用。
肺癌是一種嚴重威脅人類健康和生命的疾病，其臨床表現復雜，難以早期發現，對其綜合治療的機會變小［1］ 。 隨著中醫藥的不斷發展，越來越多的中藥可以用于抗腫瘤治療，改善癥狀，提高腫瘤患者生存質量。中醫中藥作為肺癌的輔助治療，是目前臨床肺癌治療中不可或缺的重要部分［2］ 。
目前，在肺癌的動物實驗中大多使用小鼠皮下種植肺癌細胞系，在皮下形成肺癌腫瘤結節的動物模型，如孫秋艷等［3］ 用體外培養的 Lewis細胞懸液注射于小鼠左側腋下，形成皮下腫瘤。這種肺癌模型成瘤率高，基本可以達到 100% ，并且周期短，適合腫瘤的活性篩選和評價。但是， 皮下接種瘤脫離了原位微環境的影響，往往和臨床實際情況不符［4］。為了保證動物模型和臨床結果的一致性，本實驗擬采用 Lewis肺癌細胞滴氣管，建立小鼠 Lewis原位肺癌模型，觀察新加麻黃附子細辛湯對肺癌的治療作用。
1 材料與儀器
1． 1 實驗細胞 小鼠 Lewis 肺癌細胞( LLC)， 購于中科院上海細胞庫。
1． 2 實驗動物昆明小鼠，雄性，由河南省醫學實驗動物中心提供。
1． 3 藥品及試劑 新加麻黃附子細辛湯制備方法:分別稱取原藥材麻黃 10 g、細辛20 g、附子20 g、半夏50 g(即按照1∶ 2∶ 2∶ 5 進行組方)，混合后自來水沖洗干凈，加水量沒過藥面，浸泡30min，中火煎煮，時間30min，取水煎液。重復上述過程，共煎煮 3 次。合并 3 次濾液加熱濃縮至 400mL，使水煎液濃度為10 g/kg。
試劑 包 括:體積分數為10% 的胎牛血清、DMEM 培養基、質量分數 0． 25% 的胰酶(美國Hyclone 公司產品)、生理鹽水、戊巴比妥鈉、PBS 緩沖液、蘇木精、鹽酸酒精、伊紅。
1． 4 實驗儀器CO2 細胞培養箱(賽默飛世爾科技有限公司);HDL 超凈工作臺( 北京東聯哈爾儀器制造有限公司);高速冷凍離心機(北京京立離心機有限公司);電子天平(上海精密科學儀器有限公司);電子體溫計(泰克曼電子儀器有限公司);YSL-1A多功能小鼠自主活動記錄儀(淮北正華生物儀器設備有限公司);KD202C轉輪式切片機( 浙江金華科迪儀器設備有限公司)。
2 實驗方法
2． 1 細胞培養 將小鼠 Lewis肺癌細胞置于含體積分數 10% 的胎牛血清及 DMEM 完全培養液中， 在 37 ℃、體積分數為 5 % 的 CO2培養箱中培養，2 ～ 3 d 更換 1 次培養液，質量分數為 0． 25% 的胰蛋白酶消化傳代。待細胞達到所需量時，顯微鏡下計數，調至所需要濃度。
2． 2 造模 先以 0． 2 mL(約 1 × 106個細胞)接種于昆明小鼠腋下，20 d 后以頸椎脫臼法處死荷瘤小鼠，體積分數為 75% 的酒精浸泡消毒，無菌條件下剝離腫瘤組織，剪碎后用預冷的無菌生理鹽水洗凈，用組織研磨器研碎，制成瘤細胞懸液，1 000r /min，5 min，離心 2 次，加入生理鹽水調整細胞濃度為 5 ×106 個/mL。體積分數 0． 5% 的戊巴比妥鈉溶液， 按 0． 1 mL /10 g 體質量劑量對昆明小鼠進行腹腔注射麻醉，取上述瘤細胞懸液10 μL 滴入昆明小鼠氣管中。
2． 3 分組及給藥 造模后將 36 只昆明種雄鼠隨機分為 3 組， 每組12 只，分別為:新加麻黃附子細辛湯組(即復方組)、模型組、正常組。復方組及模型組次日開始給藥， 復方組以 10 g/kg 灌胃給藥，2 次/d;模型組以 0． 2 mL /10 g 蒸餾水灌胃，2 次/d。正常組按正常方式飼養。
2． 4 檢測指標及方法 實驗開始后各組動物每周記錄體質量、水食量、自主活動等變化情況，以此對比小鼠的活躍程度。實驗結束后，小鼠摘眼球取血，頸椎脫臼法處死小鼠，解剖分離得到肺組織，計算小鼠肺組織表面的腫瘤數目及致瘤率。
2． 5 病理檢測 小鼠處死后， 取各組小鼠肺組織用體積分數為4% 的多聚甲醛固定， 常規石蠟包埋、切片、HE 染色、乙醇脫水、透明、封片，顯微鏡下觀察肺組織病理學變化。
2． 6 統計學分析采用 SPSS18． 0 統計軟件分析處理，實驗數據以x珋± s 表示，采用單因素方差分析和 t 檢驗，P ＜0．05 表示有統計學意義。
3 實驗結果
3． 1 對小鼠體質量變化的影響 正常組小鼠體質量明顯增加，模型組小鼠體質量呈逐漸減輕的趨勢小鼠狀態明顯下降，復方組小鼠體質量相對平穩。圖 1。
3． 3 對小鼠自主活動的影響各組小鼠的自由活動次數隨著試驗時間的增長而逐漸減少，復方組小鼠的自由活動次數雖有所下降，但是仍然較模型組高。說明復方組小鼠比模型組精神狀態好，具有顯著性差異。見圖 4。
3． 4 新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis原位肺癌腫瘤數目和致瘤率的影響
圖 5 可見，正常組肺組織鮮紅;Lewis 原位肺癌模型組有明顯的肺損傷，腫瘤區域較多;復方組肺組織表面比模型組腫瘤數減少。
用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立的 Lewis原位肺癌模型 8 周后腫瘤數目平均為 17 ±3． 05， 致瘤率為91% ;而復方組在相同時間內腫瘤數目為 12 ±1． 53，致瘤率為 69% ，具有顯著性差異 (P ＜0．05 )。
表明新加麻黃附子細辛湯對小鼠 Lewis原位肺癌具有治療作用。
3． 5 病理學檢測結果
將各組小鼠的肺組織切片進行 HE 染色，在顯微鏡下觀察到:正常組小鼠肺部切片未見癌細胞， 結構排列整齊;模型組小鼠肺組織間聚集有片狀核大深染的腫瘤細胞，出現明顯癌變，出現核裂解現象，細胞核大而清楚，核仁增大，細胞核與細胞質比例失常，細胞核密集，空洞逐漸變小;復方組細胞核明顯小于模型組，有少量的腫瘤細胞進入，說明新加麻黃附子細辛湯能明顯改善 Lewis肺癌模型肺組織的病理變化。結果見圖 6。
4 討論
中藥復方在抗腫瘤方面發揮著日益重要的作用，而肺癌作為最主要和最常見的腫瘤，許多復方已在其治療或輔助治療過程中體現出了很大的應用價值［5］ 。
寒邪是六淫邪氣之一， 與腫瘤的發病機制關系密切［6］。《傷寒論》中記載麻黃附子細辛湯， 方中麻黃解表發汗，除太陽表之寒邪;制附子扶陽溫里暖少陰之里;細辛溫經通陽，入里佐附子溫經通少陰，助陽散里寒，出外助麻黃發汗溫經解表散寒，具有扶正解表、散寒止痛的功效［7］ 。雖然麻黃附子細辛湯有較強的散寒作用，但化痰作用偏弱。為了增強化痰作用， 在麻黃附子細辛湯基礎上增加半夏，半夏具有燥濕化痰的功效，和肺癌的發病機制相吻合，諸藥合用對肺癌具有良好的治療作用。
本研究通過麻黃細辛附子湯加半夏組成的新加麻黃附子細辛湯來研究其水煎液對小鼠 Lewis原位肺癌的治療作用。研究表明，模型組小鼠的腫瘤數目和致瘤率明顯比新加麻黃附子細辛湯多，具有顯著性差異。在生存狀態方面， 與正常組相比， 模型組小鼠體質量下降，食欲欠佳，飲水、飲食量減少， 精神狀態不好，活動減少。復方組比模型組體質量明顯上升，攝水食量有所增加，精神狀態良好。HE 染色結果表明，新加麻黃附子細辛湯組肺組織間腫瘤細胞明顯比模型組少。
綜上所述， 用 Lewis 肺癌細胞滴氣管建立小鼠Lewis原位肺癌模型，具有較好的成瘤率及轉移特性。
新加麻黃附子細辛湯是治療肺癌的一個好方劑。
