噬菌體對小鼠模型腸道微生態和代謝組的動態調控

Dynamic Modulation of the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model

噬菌體在體內如何影響細菌群落還不清楚。Hsu等人通過攜帶已知菌群的小鼠研究了這個問題。噬菌體捕食直接影響對應的敏感（susceptible）細菌，導致對其他細菌物種的級聯（cascading）效應，并對腸道代謝組產生影響。因此，噬菌體可以用來調節菌群和宿主。

翻譯：秋芒樹 帝國理工碩士畢業，目前失學失業，求收留ヾ(@^▽^@)ノ

責編：文濤 南京農業大學

原文鏈接：https://www.cell.com/cell-host-microbe/fulltext/S1931-3128(19)30246-X

Cell Host and Microbe [IF:17.872]

DOI: https://doi.org/10.1016/j.chom.2019.05.001

Resource 2019-06-04

第一作者：Bryan B. Hsu^1,2

合作作者：Travis E. Gibson³, Vladimir Yeliseyev³, Qing Liu³, Lorena Lyon^1,2, Lynn Bry³,

通訊作者：Pamela A. Silver^1,2, Georg K. Gerber^3,4

Email: pamela_silver@hms.harvard.edu (P.A.S.), ggerber@bwh.harvard.edu (G.K.G.)

1 哈佛醫學院系統生物學系 (Department of Systems Biology, Harvard Medical School, Boston, MA 02115, USA)

2 哈佛大學威斯生物啟發工程研究所 (Wyss Institute for Biologically Inspired Engineering, Harvard University, Boston, MA 02115, USA)

3 美國 波士頓 馬薩諸塞 宿主微生物互作中心 哈佛（附屬）的布里格姆婦女醫院 Massachusetts Host-Microbiome Center, Department of Pathology, Brigham and Women’s Hospital, Harvard Medical School, Boston, MA02115, USA

鏈接：https://www.mr-gut.cn/papers/read/1042254347

Cell子刊：噬菌體對腸道菌群和代謝組的影響不容小覷

①給限菌小鼠定植組成明確的人腸道共生細菌群落，之后引入靶向其中特定細菌的裂解性噬菌體；

②噬菌體直接減少了其靶細菌的數量，并可與靶細菌長期共存，使對其有抗性的靶細菌富集；

③噬菌體對靶細菌的影響，通過細菌間互作，可波及到菌群中的其它非靶細菌成員，從而對菌群造成廣泛影響；

④噬菌體對腸道菌群的影響可直接改變腸道代謝組譜，包括神經遞質代謝物等可影響宿主生理的代謝產物。

主編推薦語：

噬菌體如何在體內影響菌群？《Cell Host and Microbe》發表的一項最新研究，使用限菌小鼠模型，揭示出噬菌體對其靶細菌的直接影響，可對菌群造成級聯效應，波及其它菌群成員，導致腸道代謝組改變，從而可對宿主產生影響，這些發現對于研究靶向腸道菌群的噬菌體療法，很有參考意義。

人類腸道菌群由密集定殖的微生物組成，包括噬菌體，它們彼此之間，以及與哺乳動物宿主之間具有動態相互作用。為了解決噬菌體如何影響腸道細菌群落的問題，我們研究了噬菌體對模型菌群的動態影響。已知的人類腸道共生細菌在無菌小鼠中定殖，并受到有關聯的（cognate）裂解噬菌體的捕食。我們發現噬菌體捕食不僅直接影響敏感（susceptible）細菌，還通過細菌間的相互作用對其他細菌物種產生級聯（cascading）效應。此外，代謝組學分析還顯示，噬菌體捕食引起的菌群變化對腸道代謝組產生了直接的影響。因此，我們的工作提供了噬菌體作為細菌定殖調節劑重要的生態學意義的見解，還表明了腸道噬菌體可以靶向調控細菌，這在哺乳動物治療方面存在潛在應用的價值。

我們的身體包含的細菌細胞數目和我們自己的細胞數目一樣多，結腸中的細菌細胞密度最大，為10¹⁴個。這種微生物組通過代謝交叉喂養和啟動免疫系統等機制有益于人類健康。相反，不平衡或衰竭的（depleted）微生物組可能是有害的。與異常微生物組相關的疾病包括營養不良、胃腸疾病、肝臟疾病、心臟疾病和大腦疾病。隨著我們對腸道微生物組在人類健康和疾病中的作用有了更多的了解，首要的問題就變成了:腸道中的哪些因素影響我們的微生物，我們應該如何利用這些知識來調控微生物組？

目前調節腸道微生物組的途徑包括飲食變化和抗生素，但這些方法會引起廣泛和潛在的長期干擾。對于腸道微生物組處于初期（nascent）狀態的嬰兒來說，干擾的后果尤其令人擔憂，因為干擾會在短期內導致菌群多樣性減少和不穩定增加，長期可導致過敏性疾病、肥胖癥和哮喘發病率增加。對成年人來說，腸道微生物組被廣泛破壞會導致短暫或更長時間的功能障礙狀態，稱為失調（dysbiosis），通常情況下，生態多樣性會減少。因此，從基本的科學和治療角度來看，需要在復雜的群落中更精確和合理地調節腸道菌群的策略。實現這一目標的有前途的方法是研究腸道細菌的生態拮抗劑（ecological antagonists）- 噬菌體。類似于為治療目的研究天然產物或其衍生物，研究噬菌體在腸道中的作用可以為下面這些問題闡明新的路徑：

(1)有目的性和合理地調控特定細菌；

(2)闡明細菌間和細菌-哺乳動物宿主相互作用介導的因果關系，以及

(3)最終設計精確和可預測的方法來重塑腸道微生物群落以達到治療目的。

噬菌體是原核病毒，是腸道中最豐富的微生物之一，但也是最不為人知的微生物之一。這些病毒通常通過對細菌裂解性侵染或溶源性侵染來繁殖，通常具有物種水平的特異性。雖然它們的宏基因組組成與炎癥性腸病和營養不良等疾病有關，但對噬菌體在腸道中的實際作為仍知之甚少。類似于理解宏觀環境中頂級捕食者的重要性，闡明噬菌體的捕食行為有可能在胃腸生態系統中提供類似的見解。然而，追蹤噬菌體捕食對哺乳動物宿主和微生物代謝的因果關系極具挑戰性。被已知的、物種數量有限的，但仍然復雜的細菌群落所定殖的無菌小鼠，為全面表征噬菌體在腸道環境中的行為提供了一個有吸引力的模型系統。

例如，Reyes等人將從糞便中純化出來的未經描述的（uncharacterized）類病毒顆粒（viral like particles）混合物施加于已經定殖有15種細菌無菌小鼠中，并從噬菌體基因組的增加和細菌基因組的減少中得出結論，即可能是逐步（stepwise）的噬菌體-細菌感染機制在起作用。盡管作者推斷了兩種噬菌體的噬菌體-細菌相互作用，但他們無法類似地識別在施加噬菌體后，其他三種噬菌體在腸道中持續存在的易感細菌。他們的研究的缺陷在于，無法在體外驗證這些相互作用，并且他們研究中使用的是未經描述的噬菌體，這就會帶來含混不清的影響。這些缺陷都突出表明了需要利用一組確定的、經過描述的噬菌體和一組確定的細菌群落。

在這項工作中，我們將裂解性噬菌體施加在已經被一組確定的人類共生細菌中定殖的無菌小鼠中，并使用高通量測序和定量PCR縱向地跟蹤每種微生物的反應。我們發現噬菌體導致腸道中敏感（susceptible）物種被靶向地敲低（knockdown），并通過細菌間的相互作用進一步調節其他的細菌，導致這些物種的大量繁殖或者滅亡（blooms and attrition）。通過比較一個完整細菌群落的定殖模式和那些被噬菌體靶向排除了的細菌物種的定殖模式，我們發現了噬菌體同時捕食的因果效應。

利用廣泛的代謝譜，我們證明噬菌體捕食不僅引起細菌的組成變化，并調節腸道代謝組。這些發現暗示了噬菌體捕食對哺乳動物宿主的影響，以及噬菌體在治療中的潛在用途。

Phages Are Specific for Individual Species among Representative Human Gut Commensals

我們構建了一個由兼性厭氧和專性厭氧共生細菌組成的微生物群落模型，可以穩定地在無菌小鼠中定殖。

這十個選定的物種代表了人類腸道微生物組中的主要門，即厚壁菌門(Firmicutes) 中的Clostridium sporogenes和Enterococcus faecalis、擬桿菌門(Bacteroidetes)中的Bacteroides fragilis,Bacteroides ovatus,Bacteroides vulgatus和Parabacteroides distasonis、變形菌門(Proteobacteria)中的Klebsiella oxytoca, Proteus mirabilis,Escherichia coli和Nissle 1917和疣狀球菌門(Verrucomicrobia)中的Akkermansia muciniphila。所選的每一個物種都很容易從菌株集合中獲得，也可在體外培養，并具有遺傳特征。我們選擇了其中四個物種的轉移裂解性噬菌體，因為它們在微生物庫中可獲得，也可以在過去的文獻中檢索到相關的描述，分別是E. coli的T4噬菌體、C. sporogenes的F1噬菌體、B. fragilis的B40-8噬菌體和E. faecalis的VD13噬菌體。

我們首先通過測試噬菌體對一組人類腸道共生細菌的裂解能力來驗證噬菌體的特異性。我們使用斑點試驗（spot assay），測試了每種細菌對5毫升的每種裂性噬菌體的敏感性(~10⁹pfu/毫升)。根據細菌的培養條件，在37℃好氧或厭氧培養后，我們發現

T4噬菌體、F1噬菌體、B40-8噬菌體和VD13噬菌體只裂解它們的敏感細菌，對其他共生細菌沒有明顯影響。

(A)用含有2 10 ⁶至

2 10 ⁷cfu的細菌混合物對單獨飼養的無菌C57Bl/6小鼠(n = 5)進行口服管飼（gavage）。在第16.1天和第30.1天，用碳酸氫鈉灌胃以中和胃酸，隨后每種噬菌體飼喂 2 * 10⁶pfu。在整個實驗過程中定期收集糞便樣本，使用分子方法對其中的細菌和噬菌體進行定量。

(B)每種噬菌體和靶向的細菌的濃度分別顯示為(每克糞便中估計的pfu)和(每克糞便中估計的cfu)。y軸的濃度以log₁₀轉化后顯示。

(C)小鼠選定樣品中E. faecalis的數量(n = 5)和體外測定的抵抗VD13噬菌體裂解的菌落百分比。

2 噬菌體在哺乳動物腸道中減少靶向細菌的數量并與其共存，產生了易感細菌和抗性細菌的混合種群

Phages Knockdown and Coexist with Targeted Bacteria in the Mammalian Gut and Lead to Mixed Populations of Susceptible and Resistant Bacteria

我們試圖在復雜但已知的腸道細菌群落中描述噬菌體及其靶向細菌的行為。

如圖1A所示，我們用我們定義的細菌群落接種無菌小鼠(A. muciniphila和P. mirabilis, 每種2 10⁶cfu，其他每種2 10⁷cfu)，然后引入噬菌體(每種噬菌體2 10⁶ pfu)，用來靶向細菌種群的子集。使用T4噬菌體和F1噬菌體分別靶向E. coli 和C. sporogenes ，接著使用B40-8噬菌體和VD13噬菌體分別靶向B. fragilis 和E. faecalis*。噬菌體成對施用，以探測多重同時擾動（multiple simultaneous perturbations）是否可能具有協同或抵消效應。每組噬菌體都包含針對兼性厭氧菌和專性厭氧菌的噬菌體，以減少潛在的一組噬菌體對另一組噬菌體的偏差。收集了一系列糞便樣本，在施加噬菌體前后收集的頻率更高，期望獲得豐富的動態變化信息。

我們結合了定量PCR和高通量測序（next-generation sequencing techniques ）對檢測噬菌體和細菌，從推算出噬菌體和細菌濃度。與所有高通量分子生物學方法一樣，可能引入了以前已經記錄過的與樣品儲存和DNA提取等因素相關的偏差。除此之外，我們還發現在細菌總濃度的推算中引入了偏差。為了減少這些偏差對我們結果的影響，我們利用我們研究的時間序列設計，主要分析個體物種隨時間的變化(例如，施加噬菌體前后)。

我們的分析表明噬菌體和它們的靶向共生細菌都存在于腸道中。施加噬菌體4-6小時后，每種噬菌體都可以被檢測到，之后在整個實驗期間都可以被檢測到(圖1B)。先前的研究發現，持續缺乏易感細菌，無菌小鼠中的T4噬菌體，無法復制，在兩天內脫落。鑒于這些結果，我們感興趣的是確定在我們的系統中持續存在的細菌是否獲得了對噬菌體的抗性。因為我們的細菌群落包含系統發育多樣性的菌株和密切關聯的菌株，如在天然腸道微生物群落中發生的，為了噬菌體抗性測定的需要從糞便中分離單個細菌物種是一項挑戰。然而，使用選擇性培養基，我們能夠從糞便中分離E. faecalis，并測試其對VD13噬菌體的敏感性。

如圖1C所示，在噬菌體施用前(第27.1天)和之后不久(第30.5天)，E. faecalis的分離株完全對噬菌體是易感的(敏感性極限，1.6%)。然而，在第2天(第32.3天)和第10天(第40.2天)后，分別發現28%和68%的被測菌落具有噬菌體抗性。當結合E. faecalis濃度的變化考慮時，這些結果表明噬菌體定向敲低（knockdown）細菌(~ 2個數量級)導致噬菌體抗性亞群的富集。

Phages Induce Cascading Effects in Species in the Microbiota Not Directly Targeted

對每種細菌物種的縱向跟蹤表明，噬菌體捕食誘導微生物數量變化，包括對噬菌體不敏感的細菌物種。當根據估計的每個物種的濃度檢查細菌組成時(圖2A)，我們發現施加噬菌體會誘導群落中低豐度（abundance）和高豐度的物種發生轉變。例如，在第16.1天施加第一組靶向E. coli和C. sporogenes的噬菌體后，低豐度物種B. vulgatus、P. mirabilis和P. distasonis(~10⁶，估計的每g糞便中細菌數)和高豐度物種A. muciniphila和B. fragilis（(~10⁸估計的每g糞便中細菌數)都發現了可以觀察到的轉變。但第30.1天施加第二組噬菌體的作用不太明顯，即使分別檢查每個物種，變化依然不明顯。第一組噬菌體與第二組噬菌體觀察到的這些非常不同的效應突出了噬菌體效應的特異性，并且反對了噬菌體施加本身的任何系統性效應的說法(例如，口服灌胃或載體效應產生的壓力)，這些發現都與之前的研究一致。

Effect of Phage on the Commensal Gut Microbiota

(A)估算的糞便中的細菌豐度，下圖是頂圖的放大版本，用來展示低豐度的信息。來自單獨飼養小鼠(n = 5)的每種細菌物種估算的細菌濃度的幾何平均值顯示在堆疊條形圖中。y軸為線性刻度。

(B, C)每種細菌物種的豐度取對數變換(log₁₀)，數據來源于圖2A，由第一組噬菌體(B)和第二組噬菌體(C)的施加而產生的變化。x軸代表噬菌體施加后經過的時間，當噬菌體施加時，垂直虛線劃分 t = 0。

如圖2B所示，為了量化噬菌體施加引起的細菌定殖的變化幅度，我們計算了每種噬菌體施加后與前一天相比，濃度的變化。我們發現，在第一組噬菌體施加期間，C. sporogenes和E. coli的敲低（knockdown）導致B. vulgatus，P. mirabilis和A. muciniphila快速且大量的繁殖，隨后是P. distasonis和B. ovatus的逐漸擴張，以及B. fragilis的逐漸減少。第二組噬菌體對周圍微生物組的影響不太明顯，E. coli和C. sporogenes的擴張幅度最小，其他物種的波動接近基線。

盡管背景菌群有所變化，噬菌體捕食并沒有消滅最初存在的物種。如圖2A所示，在施加噬菌體后，沒有細菌種類被完全消除。事實上，總細菌量沒有明顯變化。有人認為捕食者的存在會給生態系統帶來更大的穩定性。在我們定義的微生物群落中的Bray-Curtis相異度（dissimilarity）顯示，隨著噬菌體的每次連續施加，小鼠之間和相鄰時間點之間的相異度（dissimilarity）逐漸減小。這一現象間接表明，微生物群落在形成是一個更穩定的系統，表明噬菌體捕食可能有利于增加細菌群落的穩定性。

Dropout Experiments of Bacteria Targeted by Phages Delineate Causal Effects of Bacterial Interactions

通過比較有靶向噬菌體施加和沒有靶向噬菌體施加的細菌定殖情況，我們揭示了噬菌體對周圍微生態（surrounding microbiota）可量化的影響。如圖3A中概念性地提出的，比較物種1存在時的細菌集合(完整聯盟，full consortium)和物種1不存在時的細菌集合(細菌缺失，Bacterial dropout)，可以洞察其對周圍微生態的促進和抑制作用；噬菌體捕食導致更大程度的細菌敲低（knockdown），其效果接近細菌缺失（dropout）。為此，選用九中細菌定殖無菌小鼠，并且依次缺失每種噬菌體的靶向細菌(圖3B)。如圖3C所示，盡管在定殖過程中總體平均細菌密度相似，但每一組小鼠都顯示出顯著的組成差異: 整體群落 = 1.13

10 ⁹估計的每g糞便中細菌數，E. coli 缺失= 7.0

10 ⁸，C. sporogenes缺失 = 1.3

10 ⁹，B. fragilis 缺失 = 1.1

10 ⁹，E. faecalis缺失 = 8.9

10 ⁸。在第16.1天，我們通過比較在缺失實驗中每個剩余物種的密度，和其在完整集合中的密度來計算每個缺失物種的影響。如圖3D所示，*每個缺失的物種對已知的集合具有不同的影響模式，這表明噬菌體對每個細菌物種的敲低都可以產生表型獨特的結果。

Impact of Bacterial Dropouts on Colonization of Consortia

(A)概念解釋：周圍微生物群落的集群密度如何對細菌缺失群落中單個物種(物種1)的缺失做出反應的示意圖。實線以箭頭終止，表示假設的促進，虛線以正交線終止，表示假設的抑制。“完整集合（Full consortium）”，即左圖，示意性地描述了細菌物種1、2和3的濃度。而“細菌敲低（Bacterial knockdown，中圖）”和“細菌缺失（‘Bacterial dropout，右圖）”設置描述了物種1減少和消除時，對物種2和物種3的影響。

(B)實驗室示意圖：為了確定細菌群落中細菌缺失的影響，使用含有九種細菌成員的細菌混合物，對四組五只單獨飼養的無菌C57Bl/6小鼠灌胃，依次缺失E. coli,C. sporogenes,B. fragilis和E. faecalis。

(C)完整（第1列）模擬群落或某種細菌缺失（第2-4列）群落的估計的總定殖密度顯示在一個堆疊柱狀圖中，該圖具有一個完整的上面板和一個放大的下面板，下面板顯示低豐度物種。y軸以線性比例顯示，每種細菌的濃度是從每組小鼠(n = 5)計算的幾何平均值。

(D)在第16.1天，細菌缺失群落中每個細菌物種對數(log10)變換定殖差異倍數。每個條代表平均值 ± 標準差。

在某些情況下，噬菌體定向敲低（knockdown）可以具有接近細菌缺失的消減效果，例如T4噬菌體，其在給藥后立即顯著減少E. coli的數量。正如我們假設的相互作用網絡所示(圖4A)，E. coli很可能通過細菌相互作用強烈促進B. fragilis并強烈抑制B. vulgatus，因此其被第一組噬菌體敲低（knockdown）可能導致B. fragilis的減少和B. vulgatus的擴張。這些影響的程度接近缺失研究中觀察到的水平(圖4C)，這可能是因為E. coli是這些細菌物種的主要影響者。

Bacterial Interaction Network in the Gut Microbiota

將定殖期限（16.1天）延長之后，比較完整的十個細菌成員集合的定殖實驗和被噬菌體靶向的細菌的缺失定殖實驗的不同，而假設的因果相互作用網絡。數據信息來源于圖3D, 這里只是將數據可視化。

(A, B) 代表E. coli與C. sporogenes(A) 和E. faecalis與B. fragilis(B)相互作用的網絡。線寬對應于細菌缺失引起的定殖密度變化，即log10轉化，實線以箭頭終止，表示假設的促進，虛線以正交線終止，表示假設的抑制。

(C，D) 在施加第一組噬菌體(T4和F1），靶向E. coli和C. sporogenes(C)和施加第二組噬菌體(B40-8和VD13），分別靶向B. fragilis和E. faecalis(D)后的選定時間點(0.3天、2天和13天)，來自與完整集合定殖的小鼠的每種物種的濃度的log10變換值。條形代表平均值 ± 標準差。

當兩個相反的效應作用于同一個物種時，因果效應就會變得模糊，不過仍然可以用相互作用網絡來合理解釋。例如，在施用第二組針對E. faecalis和B. fragilis的噬菌體后，我們發現對周圍微生物群落的定殖影響相對較小(圖2C)。然而，我們針對第二組被噬菌體靶向的細菌物種的相互作用網絡(圖4B)表明A. muciniphila,B. ovatus,B. vulgatus,P. distasonis和P. mirabilis被B. fragilis抑制，并且被E. faecalis促進。因此，施加第二組噬菌體會同時敲除這兩種被噬菌體靶向的細菌物種，這可能會將抑制或者促進的效應抵消，導致它們對群落的個體效應無效，導致對整個細菌集合定殖的影響忽略不計。

我們還觀察到由于噬菌體捕食產生的細菌時間動態的效應，這可以用細菌相互作用來解釋。例如，我們觀察到，盡管其他物種立即表現出反應，但P. distasonis在噬菌體施加約3天后才開始了擴張(圖2B)。如圖4A所示，細菌相互作用暗示了這種行為的機制。在引入第一組噬菌體后不久，C. sporogenes和E. coli分別被噬菌體F1和T4敲低（knockdown）(圖1B)，這導致它們各自失去了對P. distasonis促進和抑制的效應。隨著E. coli的持續敲低，由于去抑制作用，P. distasonis也經歷了持久的擴張。然而，C. sporogenes只經歷了最初的短暫敲低，其在最初幾天之后的恢復與P. distasonis的促進相一致，因此，解釋了P. distasonis在第3天之后開始的第二次擴張。P. mirabilis也觀察到了類似的效果，不過程度較低，這是因為C. sporogenes的促進作用較弱。

我們的結果還表明了一些更深層次的級聯效應（cascading effects），不過在我們的交互網絡中沒有捕捉到。這些效應來自于缺失實驗。如圖4C所示，通過第一組噬菌體敲低（knockdown）E. coli和C. sporogenes，導致A. muciniphila的富集大大超過缺失實驗所描述的。當我們的研究檢查了細菌集合十個成員中的四個成員的因果效應時，A. muciniphila很可能經歷了來自微生物群落其他成員(例如，B. vulgatus,B. ovatus,P. distasonis和/或P. mirabilis)的附加影響。

Bacterial Modulation Induced by Phages Impacts the Gut Metabolome

我們試圖通過腸道代謝組的變化來描述噬菌體捕食對微生物組的功能效應。總的來說，我們的預期是，大多數代謝物的水平會降低，以應對由于我們定義的細菌集合中代謝冗余而引起的干擾，但是與我們集合中特定物種特有的微生物途徑相關的化合物將對細菌組成的擾動敏感。使用非靶向代謝組學，我們研究了小鼠定殖不同階段的糞便代謝物，即無菌、穩定的細菌定殖后、引入E. coli和C. sporogenes的噬菌體后，以及引入E. faecalis和B. fragilis的噬菌體后（圖5A）。

總的來說，噬菌體引導的腸道微生物組的重建對代謝物的數量影響相對較小。第一組噬菌體的施加導致17%的受檢化合物發生統計學上顯著的變化，但有趣的是這些代謝物代表了幾乎所有的KEGG途徑(例如，氨基酸、肽、碳水化合物、脂質、核苷酸、輔因子（cofactors）、維生素和異生物質（xenobiotics）)(圖5B)。我們還發現，第二組噬菌體的在代謝產物數量方面的影響相對有限，因為只有0.7%的代謝物受到顯著影響(圖5C)，這與微生物群落相對有限的變化相一致，微生物群落的變化主要是施加噬菌體13天后E. faecalis的減少(圖5E)。相比之下，將細菌引入無菌小鼠后，糞便代謝組發生了廣泛的變化，所有KEGG途徑中總共860種代謝物中的60% (514種代謝物）增加了，15% (127種代謝物)減少了。綜上所述，這些觀察結果表明代謝組學受影響的廣度反映了腸道微生物組中組分變化的程度。

Phages Can Modulate Neurotransmitter Metabolites Uniquely Associated with Specific Bacteria

我們觀察到，在某些情況下，噬菌體捕食的特異性允許靶向特定的細菌物種，并因此敲低（knockdown）特異相關的代謝產物。色胺（Tryptamine）是一種通常來源于植物的神經遞質，但也可以由少量的共生腸道細菌通過色氨酸脫羧（tryptophan decarboxylation）產生。而這個基因在大約10%的人類腸道細菌宏基因組中存在，到目前為止僅在兩個具有遺傳特征的物種中被鑒定，即R. gnavus和C. sporogenes，后者是我們定殖的細菌集合中的成員。與我們集合的其他成員相比，R. gnavus(rumgna_01526)和C. sporogenes(clospo_02083)色氨酸脫羧酶氨基酸(tryptophan decarboxylase amino acid)序列的BLAST檢索結果顯示蛋白同源性差，這與C. sporogenes的獨特關聯相一致。在第一組噬菌體施加期間，我們檢測到色胺分別在0.3、2和13天降低了10、17和2倍，如圖5F所示的氨基酸途徑所示。這分別對應于C. sporogenes降低840倍、4倍和4倍(圖5D)。

作為另一個例子，神經遞質酪胺（tyramine）是由產乳酸的細菌（lactic acid bacteria），包括E. faecalis，通過酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylation）產生的。E. faecalis是我們細菌集合中唯一的產乳酸的細菌。我們在文獻中沒有發現酪氨酸脫羧酶（yrosine decarboxylase）與其他聯盟成員的關聯，也沒有發現與E. faecalis的tyrDC蛋白有任何顯著的蛋白同源性。這與酪氨酸脫羧（tyrosine decarboxylation）功能只與E. faecalis有關相一致。施加第二組噬菌體導致酪胺（tyramine）減少4、2.7和4倍(分別在0.3、2和13天)，如圖5G的氨基酸途徑所示。這相對應于E. faecalis分別減少了1.3倍、9倍和42倍(圖5E)。由于經過實驗驗證的微生物代謝物數量有限，很難廣泛地將特定代謝物與我們細菌集合中的單個物種聯系起來。然而，色胺（tryptamine）和酪胺（tyramine）分別與C. sporogenes和E. faecalis的獨特關聯表明噬菌體、細菌和代謝物之間存在明顯的因果聯系。

Phages Can Modulate Metabolites with Known Mammalian Host Effects Associated with Multiple Bacterial Species

與微生物代謝相關的化合物更廣泛地受到噬菌體轉變的影響。例如，第一組噬菌體兩種氨基酸，絲氨酸和蘇氨酸，在糞便中的濃度增加了，這兩種氨基酸在O-glycosylated intestinal mucin中具有很高的代表性，這與我們觀察到的A. muciniphila和B. vulgatus由于噬菌體效應而富集的現象相一致。

我們還發現由于第一組噬菌體，膽鹽（bile salts）也發生了顯著變化。哺乳動物宿主產生的牛磺和糖共軛的一級膽汁鹽（Tauro- and glyco-conjugated primary bile salts）經歷微生物轉化，包括膽汁鹽水解酶(bile salt hydrolases，BSH)的氨基酸解共軛（deconjugation）和羥基類固醇脫氫酶(hydroxysteroid dehydrogenases，HSDH)的脫氫。

我們發現第一對噬菌體對細菌群落的調節增加了去偶聯膽汁鹽(deconjugated bile salt)，

膽酸鹽硫酸鹽(cholate sulfate)，并減少共軛膽汁鹽(conjugated bile salt)，牛磺鵝去氧膽酸7-硫酸鹽(taurochenodeoxycholic acid 7-sulfate)(圖5F)。我們發現第一對噬菌體對細菌群落的調節增加了去共軛膽汁鹽膽酸鹽硫酸鹽(cholate sulfate)，并減少了共軛膽汁鹽牛磺鵝去氧膽酸7-硫酸鹽(圖5F)。

這表明膽汁鹽水解酶（BSH）的活動增加了，我們發現這主要與我們的細菌集合(B. fragilis,B. ovatus,B. vulgatus,C. sporogenes,E. faecalis,E. coli,P. distasonis和P. mirabilis)有關，如MetaCyc數據庫中所述。我們還檢測到兩種去偶聯的次級膽鹽（deconjugated, secondary bile salts）的增加，這兩種膽鹽在無菌小鼠中沒有檢測到，因此是微生物來源的12-去氫膽酸鹽（12-dehydrocholate）和ursocholate。前者由12a-HSDH的活動產生，而后者由7a-HDSH和7b-HDSH連續活動產生。與直覺相反，每種酶都與B. fragilis,C. sporogenes和E. coli相關，這三種細菌在第一組噬菌體施加后相應減少。還可能涉及其他因素，包括主要宿主對膽鹽吸收的變化，以及其他成員對膽鹽代謝的能力，這些都有待于實驗的證實。

Analysis of the Fecal Metabolome

(A)從被已知的細菌群落定殖的無菌(GF)小鼠中收集糞便樣品，然后施加第一組噬菌體(T4和F1)和第二組噬菌體(VD13和B40-8)(n = 5)。為了確定糞便代謝物濃度的相對變化，將測得的代謝物量標準化為噬菌體施加之前的量。圓圈表示對糞便采樣，箭頭表示比較。

(B, C)火山圖顯示，在施加第一組噬菌體(B)后13天和在施用第二組噬菌體(C)后13天，每種代謝物增加的顯著性(y軸)對倍數變化(x軸)，水平虛線上方的點表示錯誤發現率調整后的 p < 0.05的顯著變化。

(D, E)為了幫助直接比較每種代謝物相對于細菌群落的變化，細菌濃度（每克糞便中的細菌數目）平均倍數變化的分層聚類。在引入第一組噬菌體(D)和第二組噬菌體(E)后，用Log2比例的熱圖顯示。

(F, G)在施加第一組噬菌體(F)和第二組噬菌體(G)后，用Log2比例的熱圖對顯著變化(錯誤發生率（FDR）調節后的p < 0.05)的代謝物進行分層聚類。無菌（GF）小鼠中每種代謝物存在的截止時間是在5只小鼠中的至少4只中檢測到的時間。文中討論過的代謝物以粗體顯示。

我們的結果表明，裂解性噬菌體不僅敲低（knockdown）了它們的靶向細菌，還通過級聯效應影響定殖在腸道的共生細菌群落中非靶向的細菌物種。我們的研究揭示了一個高度互動和動態的群落，其中裂解性噬菌體共存并敲低靶向細菌，其效果通過微生物組的其他成員傳播，最終調節腸道代謝組。

我們的工作建立在先前研究的基礎上，最大限度利用我們實驗設置的優勢并提供了見解。雖然已經提出噬菌體在系統發育組成方面作用不大，但是先前所采用的NGS方法通常只獲得屬水平的分辨率，這可能掩蓋了物種水平的變化。我們使用確定細菌集合的結果表明，噬菌體捕食對非靶向細菌物種的影響可能沒有得到充分認識。另一項研究同樣使用無菌小鼠，他們的結果表明，噬菌體捕食會導致小鼠腸道微生物群落的組成發生變化，但是它們使用的是沒有描述過的噬菌體混合物，不能在體外驗證噬菌體在細菌群落中的感染性。并且他們使用相對豐度縱向跟蹤腸道細菌，沒有使用絕對濃度，這就很難研究清楚捕食過程中的直接影響和間接影響。通過噬菌體-細菌相互作用的體外驗證，我們可以將噬菌體靶向敲低（knockdown）的效果與隨后通過細菌間相互作用對微生物群調節的效果分開。如圖2中所示，很明顯，對細菌物種的靶向調節對腸道中定殖的其他物種具有后續效應。

雖然噬菌體捕食通常是在物種級別或菌株級別對細菌的特定影響來觀察的，但我們的結果強調了細菌群落內細菌間相互作用和潛在級聯效應的重要性。我們的發現與胃腸環境(如密集定居、生態位競爭和營養限制)如何促進物種間激烈競爭和合作的新認識一致。盡管細菌間的相互作用顯然很重要，但鑒于目前可用的工具有限，在體內進行實驗鑒定和確實是一項挑戰。類似地，在分子生物學中，確認基因功能的一般策略是使用基因敲除來驗證功能喪失，然后通過將基因重新引入敲除體來驗證功能的重新獲得。我們的結果表明噬菌體可以為微生物組提供類似的信息，盡管是以分級（graded），而不是以絕對的方式。

多種噬菌體的合理部署可以選擇性地調節某些物種，同時最小化對周圍微生物群的級聯影響。例如，E. faecalis和B. fragilis的模擬敲除導致微生物群落中最小的級聯效應，盡管在定殖密度上，E. faecalis(~10⁵， 每克糞便中的細菌數)和B. fragilis(~10⁷，每克糞便中的細菌數）在定殖密度上存在巨大的差異。一種可能性是先施用E. coli和C. sporogenes的噬菌體會抑制微生物組對隨后施加的B. fragilis和E. faecalis噬菌體的反應。然而，我們傾向于另一種情況，B. fragilis和E. faecalis敲低的級聯效應部分地相互抵消，這可以通過我們從菌群缺失實驗中得到的細菌間相互作用網絡來解釋。來自低豐度物種的強烈影響并不是前所未有的，以前在共生細菌相互作用中也觀察到過，例如低豐度的Clostridium scindens抑制Clostridioidies difficil感染，我們的結果強調了這種影響也可能發生在共生細菌相互作用中。我們對各種相互作用的識別引出了一個有趣的后續問題，即這些細菌如何調節它們對哺乳動物腸道生態系統的影響。除了直接的相互作用，如交叉喂養、抗菌肽、群體感應（quorum sensing）和營養競爭，細菌還可以招募宿主來改變局部環境，比如通過炎癥的方式。總的來說，我們的發現表明，具有適當特性的噬菌體可以作為研究微生物群落的動力學和相互作用結構的有力工具，提供持續的敲低或精確的瞬時擾動。

我們的結果還揭示了噬菌體在腸道微生物組中的捕食作用對哺乳動物宿主有潛在的影響，這可以通過腸道代謝組的調節來證明。微生物代謝物在調節細菌和哺乳動物宿主之間的相互作用中具有重要作用，噬菌體和微生物代謝物之間的聯系提供了一種有趣的治療途徑。其他細菌調節方法，如抗生素，可能對微生物代謝產生長遠和不可預測的影響，鏈霉素（streptomycin）和頭孢哌酮（cefoperazone）證明了這一點，它們分別影響了能夠檢測到的小鼠糞便代謝物中的87%和53%。相比之下，噬菌體可以引發物種靶向效應，比如：以通過噬菌體對減少色胺（tryptamine）的C. sporogenes的捕食可以加速胃的流動性。對減少酪胺（tyramine）的E. faecalis的捕食可以誘導回腸收縮。盡管仍然需要做大量的工作來表征腸道微生物代謝，但是噬菌體對細菌靶向敲低可以調節微生物代謝，這是一種可以用于治療目的的潛在途徑。

噬菌體和敏感細菌的縱向特征使我們能夠觀察噬菌體在腸道微生物群中的捕食動態。我們的發現之一是裂解性噬菌體在腸道中持續存在，被靶向的細菌經歷了敲低（knockdown）而不是根除，這與我們發現的T4噬菌體與E. coli共存一致。過去的研究表明，T4噬菌體可以在哺乳動物腸道中的易感細菌上繁殖，更一般地說，裂解性噬菌體和細菌可以共存數周。有趣的是，T4噬菌體和一種類T4（T4-like）噬菌體ED6在用E. coli單一定殖的小鼠中僅持續一天至兩天，而另一種裂解性E. coli噬菌體T7卻持續數周。綜上所述，這些結果表明背景菌群可能是維持噬菌體在腸道中繁殖的重要因素，這可能是通過細菌間的相互作用發揮作用的。

已經提出噬菌體不能完全根除靶向細菌是由于遺傳或生態抗性機制。在我們的研究中，我們發現以E. faecalis為靶標的裂解性噬菌體的引入導致在最初的噬菌體易感群體中出現大量噬菌體抗性突變體。先前的工作已經表明Vibrio cholerae對裂解性噬菌體的遺傳抗性的發展與適應性受損相一致，允許易感菌株持續存在并因此繁殖噬菌體。在體外和其他生態系統中也觀察到了類似的抗性適應成本，這可能解釋了為什么在人類腸道病毒中幾乎沒有觀察到細菌抗性和噬菌體捕食之間共同進化的證據。其他機制，如細菌物理上無法接觸噬菌體的生態抗性，也可以解釋為什么噬菌體靶向細菌會在腸道中持續存在。此外，體外研究表明，噬菌體在粘膜表面的擴散減少，這表明與管腔相比，噬菌體在腸粘膜中的感染動力學可能發生改變，這可能解釋了噬菌體對B. fragilis(一種對腸粘膜具有更大嗜性的物種)的捕食作用與通常在管腔中發現更多的E. coli的捕食作用的差異。

微生物的復雜性和多樣性以及它們在腸道中的相互作用帶來了巨大的實驗挑戰。一般來說，每個個體的人類腸道微生物組都是獨特的，通常有不可培養且難以在系統發育上進行分類的微生物組成，經常受到生活方式、藥物、飲食和環境因素的干擾，并受到哺乳動物宿主的相互影響。因此，為了研究與人類腸道微生物組相關的復雜生物過程的機制，必須在模型對人類腸道的再現程度和實驗實用主義之間達成妥協。我們使用的遺傳近交的非繁殖小鼠模型中有10種可培養的已描述的人類共生細菌菌株，包括了適度的復雜性和細菌多樣性，同時將潛在的混淆變量（confounding variables）降至最低。我們發現裂解性噬菌體可以在腸道微生物群中發揮廣泛的意想不到的實質性的作用，但是這僅僅是它們潛在功能影響的一個微弱表現，因為它們具有不同的生活方式(例如，溶源的生活方式)、對于細菌物種的不同的侵染性范圍以及水平基因轉移的潛力。此外，盡管噬菌體在細菌物種之間通常具有狹窄的侵染性范圍，但是它們可以在相同物種的菌株之間表現出廣泛的侵染性。因此，該領域的一個重要目標將是開發在完全完整的微生物群落中表征噬菌體效應的方法，例如在常規小鼠或人類群體中。通過闡明噬菌體和共生細菌在一個簡化但仍然真實的腸道環境中的動態關系的細節，我們的工作提供了一個框架來指導這些未來在更復雜環境中的研究，這些研究將尋求闡明噬菌體、微生物群和宿主健康和疾病之間的相互作用。

據小編有限的淺薄的知識來看，這是第一篇描述噬菌體在腸道中功能的文章，以前有研究在腸道中噬菌體與細菌相互作用的動態變化的文章。所以這篇文章還是具有十分重要的意義。不過他們使用的是，用經過描述過的已知細菌構建的一個人工的細菌集合。如果在一些自然狀態下具有簡單細菌組成的模式動物中，進行類似的實驗，那我們對噬菌體在腸道中的作用會有更加清晰的認識。

這篇文章的實驗思路可能有些復雜，小編在此簡單整理一下，如有錯誤，歡迎批評指正。這篇文章一共進行了兩組實驗，實驗設計參照圖1A,圖3B和圖5A。其中圖1A和圖5A描述的是施加噬菌體實驗，在兩個時間點施加不同的兩組噬菌體。圖3B描述的是，十缺一的細菌缺失實驗。那這兩組實驗的關系是什么呢？

我的理解是，在第一組施加噬菌體的實驗中，一共施加了兩對不同的噬菌體，隨后對細菌集合中的成員產生了非常不同的效應。其中的原因是什么呢？作者試圖用第二組十缺一的細菌缺失實驗來解釋兩對不同的噬菌體產生的不同的效應。作者認為噬菌體對細菌的定向敲低（knockdown）可以具有接近細菌缺失的消減效果。第二組實驗使用十缺一的細菌定殖無菌小鼠，觀察數量的變化，得到在一種細菌缺失的情況，其中細菌的數量變化，進而得出了細菌之間相互作用的網絡圖，如圖4A和圖4B所示。發現這個網絡關系用來解釋第一組的結果是說得通的。

Hsu, BB, Gibson, TE, Yeliseyev, V, Liu, Q, Lyon, L, Bry, L, Silver, PA, and Gerber, GK. (2019). Dynamic Modulation of the Gut Microbiota and Metabolome by Bacteriophages in a Mouse Model. Cell Host & Microbe25, 803-814.e805.

https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S193131281930246X?via%3Dihub