兩種檢測(cè)抗雙鏈DNA抗體方法的比較
安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào) 2000年第5期第35卷 臨床醫(yī)學(xué)研究
作者：汪國(guó)生 張宏 吳向輝 李向培
單位：安徽省立醫(yī)院風(fēng)濕科，合肥 230001
關(guān)鍵詞：DNA；抗體；分析；膠體金；免疫印跡法
摘要 目的 比較斑點(diǎn)免疫金膠體滲濾法（DIGFA）和間接免疫熒光法（IIF）檢測(cè)抗ds-DNA抗體。 方法 采集內(nèi)科門(mén)診和住院患者血標(biāo)本2 100份，其中同期住院的系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）118例155份標(biāo)本、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（RA）44例44份標(biāo)本。同時(shí)檢測(cè)ANA（IIF法）、抗ds-DNA抗體（IIF法和DIGFA法）。結(jié)果 2 100份標(biāo)本、住院SLE和RA患者DIGFA法檢測(cè)抗ds-DNA抗體的檢出率均顯著高于IIF法，分別為9.86%對(duì)4.71%、54.24%對(duì)35.59%和2.27%對(duì)0%。兩種方法的符合率分別為94.95%、77.97%和97.73%。以IIF為金標(biāo)準(zhǔn)，DIGFA檢測(cè)抗ds-DNA抗體的敏感性和特異性分別為91.92%和94.20%。在2 100份檢測(cè)及住院SLE患者分別有16.36%和25.92%在IIF法抗體轉(zhuǎn)陰時(shí)，DIGFA法抗ds-DNA抗體仍呈陽(yáng)性。結(jié)論 DIGFA法檢測(cè)抗ds-DNA抗體簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果直觀，檢出率高于IIF法，有助于SLE的回顧性診斷，可以替代IIF法或?qū)IF法補(bǔ)充。
[-hzh-] 中圖分類號(hào) R446.62 ；R392.11 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A
文章編號(hào) 1000-1492(2000)05-0357-03
抗雙鏈DNA（ds-DNA）抗體是系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systyemic lupus erythematosus, SLE）比較特異的抗體，是SLE的診斷標(biāo)準(zhǔn)之一，與SLE的腎損害相關(guān)，是評(píng)價(jià)SLE疾病活動(dòng)指標(biāo)之一。經(jīng)典的檢測(cè)方法是以馬疫錐蟲(chóng)或短膜蟲(chóng)為底物的間接免疫熒光法(indirect immune fluorescent ,IIF)，但陽(yáng)性率僅30%～40%，且需要熒光顯微鏡，基層單位難以開(kāi)展。放射免疫法雖較IIF法敏感，但同樣需要一定的檢測(cè)儀器。兩種檢測(cè)方法都費(fèi)時(shí)費(fèi)力，需要一定的檢驗(yàn)技術(shù)。我科自1996年6月～1998年6月同時(shí)開(kāi)展了斑點(diǎn)免疫金膠體滲濾試驗(yàn)（dot immuno-gold filtration assay, DIGFA）和IIF法檢測(cè)抗ds-DNA抗體。現(xiàn)將兩種檢測(cè)方法結(jié)果比較如下。
1 材料與方法
1.1 一般情況 送檢血清來(lái)自本院內(nèi)科門(mén)診及住院患者，計(jì)2 100份，男性424份，女性1 676份，年齡9～72歲，平均39.6歲±20.6歲。其中包括同期住院的SLE患者118例155份標(biāo)本，類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)患者44例44份標(biāo)本。SLE的診斷符合1982年美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)的診斷標(biāo)準(zhǔn)〔1〕，狼瘡活動(dòng)的判斷依據(jù)系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動(dòng)指標(biāo)（SLEDAI）〔2〕。RA診斷符合美國(guó)風(fēng)濕病學(xué)會(huì)1987年診斷標(biāo)準(zhǔn)〔3〕。所有血清均同時(shí)檢測(cè)了抗核抗體（ANA）、抗ds-DNA抗體。
1.2 檢測(cè)方法
1.2.1 抗核抗體 IIF法，以HEP-2細(xì)胞為底物，抗原片購(gòu)自北京協(xié)和醫(yī)院檢驗(yàn)科熒光室，具體檢測(cè)步驟如下：抗原片從冰箱中取出立即風(fēng)干，滴加1∶5稀釋的標(biāo)本，放濕盒中置37℃溫箱內(nèi)30 min，0.01 mol·L-1 pH7.2 PBS泡洗3次，每次5 min，滴加熒光素標(biāo)記的抗人IgG，放濕盒中置37℃溫箱內(nèi)30 min，PBS泡洗3次同上，緩沖甘油封片，熒光顯微鏡鏡檢，陽(yáng)性血清進(jìn)一步測(cè)定抗體滴度。
1.2.2 抗ds-DNA抗體的檢測(cè) IIF法和DIGFA兩種方法同時(shí)開(kāi)展。IIF法以馬疫錐蟲(chóng)為底物，具體操作方法參見(jiàn)抗核抗體檢測(cè)。DIGFA試劑盒購(gòu)自廣州萬(wàn)孚生物技術(shù)有限公司。具體操作方法如下：取100 μl 待檢血清于測(cè)定板上過(guò)濾器小孔內(nèi)，待血清完全滲濾后除去過(guò)濾器，加金標(biāo)液4滴于測(cè)定板小孔中待滲干，加洗板液1滴于測(cè)定板小孔中待滲干，即可觀察結(jié)果。結(jié)果判斷：測(cè)定板小孔中央的膜上出現(xiàn)紅色的“○”為陽(yáng)性，出現(xiàn)紅色的“-”為陰性，無(wú)任何顯示為試劑失效。
1.3 統(tǒng)計(jì)方法 分別計(jì)算抗ds-DNA抗體兩種檢測(cè)方法對(duì)SLE和RA患者的陽(yáng)性率、符合率。以IIF法為檢測(cè)抗ds-DNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算DIGFA檢測(cè)抗ds-DNA抗體的敏感性和特異性。計(jì)數(shù)資料的比較行χ2檢驗(yàn)或Fisher***檢驗(yàn)。
2 結(jié)果
2.1 抗ds-DNA抗體兩種檢測(cè)方法結(jié)果 2 100份標(biāo)本檢測(cè)三項(xiàng)中任一項(xiàng)陽(yáng)性者458份，全部陰性者1 642份。抗ds-DNA抗體的兩種檢測(cè)方法有124份不符合，符合率為94.95%（1 976/2 100），其中DIGFA法有207份陽(yáng)性，陽(yáng)性率9.86%，IIF法有99份陽(yáng)性，陽(yáng)性率4.71%，兩者相比差異有顯著性（χ2=40.36，P＜0.01），DIGFA對(duì)抗ds-DNA抗體的檢出率明顯高于IIF法。IIF法抗ds-DNA抗體陽(yáng)性者ANA全部陽(yáng)性，與ANA符合率為100%；DIGFA檢測(cè)陽(yáng)性者中，ANA陽(yáng)性195份，與ANA的符合率為94.20%。
2.2 DIGFA法的敏感性和特異性 如以IIF法為檢測(cè)抗ds-DNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，2 100份標(biāo)本檢測(cè)DIGFA法檢測(cè)抗ds-DNA抗體的敏感性為91.92%（91/99），特異性為94.20%（1 885/2 001），假陽(yáng)性率為5.80%（116/2 001），假陰性率為8.08%（8/99）。
2.3 SLE患者檢測(cè)結(jié)果 118例SLE共進(jìn)行155次抗核抗體和抗ds-DNA抗體的檢測(cè)，全部病例抗核抗體陽(yáng)性。抗ds-DNA抗體IIF法檢測(cè)42例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為35.59%（42/118），而DIGFA法檢測(cè)有64例陽(yáng)性，陽(yáng)性率為54.24%（64/118），DIGFA法陽(yáng)性率較IIF法高（χ2=7.55，P＜0.01）。兩種方法符合率為77.97%。在27例重復(fù)檢測(cè)的患者中，有7例（25.92%）觀察到抗ds-DNA抗體IIF法已經(jīng)轉(zhuǎn)陰，而DIGFA法仍呈陽(yáng)性。
2.4 SLE活動(dòng)期和緩解期比較 118例SLE患者狼瘡活動(dòng)期82例，緩解期36例，兩種方法檢測(cè)活動(dòng)期與緩解期抗ds-DNA抗體的陽(yáng)性率分別為DIGFA法68.29%（56/82）對(duì)22.22%（8/36），IIF法48.78%（40/82）對(duì)5.56%（2/36）。兩種方法檢測(cè)抗ds-DNA抗體都是狼瘡活動(dòng)期陽(yáng)性率高，DIGFA法檢測(cè)抗ds-DNA抗體的陽(yáng)性率在活動(dòng)期和緩解期均顯著高于IIF法（活動(dòng)期χ2=5.65，P＜0.05；緩解期Fisher***檢驗(yàn)P＜0.05）。
2.5 RA患者檢測(cè)結(jié)果 44例RA患者ANA的陽(yáng)性率為6.82%（3/44），DIGFA法抗ds-DNA抗體的檢出率為2.27%（1/44），IIF法未檢出陽(yáng)性病例，抗ds-DNA抗體兩種檢測(cè)方法的符合率為97.73%。
3 討論
抗ds-DNA抗體是SLE重要的自身抗體之一，具有致病性，有效的治療可使其滴度下降或轉(zhuǎn)陰，是觀察治療效果的***抗體。國(guó)內(nèi)目前多采用IIF法和放射免疫法檢測(cè)，因操作過(guò)程復(fù)雜、人為影響因素多、需要特殊儀器，限制了在基層單位的開(kāi)展。DIGFA化繁為簡(jiǎn)采用高度靈敏的親和素-生物素系統(tǒng)將ds-DNA包被在硝基纖維素薄膜上，結(jié)合了膠體金標(biāo)記和斑點(diǎn)滲濾技術(shù)，檢測(cè)血清中抗ds-DNA抗體，3 min內(nèi)即可觀察結(jié)果。具有簡(jiǎn)便、快速、結(jié)果直觀、不需特殊設(shè)備的特點(diǎn)。但由于DIGFA用于抗ds-DNA抗體的檢測(cè)時(shí)間短，其敏感性和特異性如何，讓人心存疑慮。國(guó)內(nèi)蘭小鵬等〔4〕報(bào)道DIGFA對(duì)未經(jīng)篩選的SLE患者抗ds-DNA抗體的陽(yáng)性率為65.6%，其中活動(dòng)期和緩解期的SLE的陽(yáng)性率分別為96.1%和10.4%，DIGFA的陽(yáng)性率與放射免疫法相似，高于酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和IIF法，而假陽(yáng)性率明顯低于放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。我們的結(jié)果與之相符，但在SLE活動(dòng)期DIGFA法抗ds-DNA 抗體的陽(yáng)性率僅為68.29%。侯麗燕等〔5〕報(bào)道27名正常兒童和17例非狼瘡患者兩種方法檢測(cè)抗ds-DNA抗體皆陰性，29例SLE患者DIGFA和IIF法檢測(cè)抗ds-DNA抗體陽(yáng)性率分別為62.07%和58.62%，陽(yáng)性符合率為94.44%，并且兩種檢測(cè)方法滴度一致。我們2年中2 100份標(biāo)本檢測(cè)顯示：2 100份標(biāo)本及其中的SLE和RA住院患者，DIGFA對(duì)抗ds-DNA抗體的檢出率均高于IIF法，兩種方法的符合率分別達(dá)94.95%、77.97%和97.73%。在2 100份檢測(cè)中，如以IIF法為檢測(cè)抗ds-DNA抗體的金標(biāo)準(zhǔn)，DIGFA檢測(cè)抗ds-DNA抗體的敏感性和特異性分別達(dá)91.92%和94.20%。SLE患者兩種方法符合率較低，主要是因?yàn)镈IGFA對(duì)抗ds-DNA抗體檢出率提高。我們觀察到兩種方法滴度并非完全一致，在2 100份檢測(cè)和SLE患者中分別有16.36%和25.92%在IIF法抗ds-DNA抗體轉(zhuǎn)陰后，DIGFA法仍陽(yáng)性。提示DIGFA檢測(cè)抗ds-DNA抗體更靈敏，對(duì)緩解或穩(wěn)定的SLE患者的回顧性診斷有幫助。116份DIGFA陽(yáng)性而IIF法陰性中只有9人12份標(biāo)本ANA始終陰性，是否是DIGFA假陽(yáng)性，正在追蹤觀察。
DIGFA是檢測(cè)抗ds-DNA抗體簡(jiǎn)便、可靠的方法，可作為對(duì)IIF法的替代和補(bǔ)充應(yīng)用于臨床。
Comparation of dot immunogold label filtration assay and indirect
immune fluorescent assay in the detection of anti-dsDNA antibody
Wang Guosheng, Zhang Hong, Wu Xianghui et al
(Dept Of Rheumatology, Anhui Provincial Hospital, Hefei 230001)
Abstract Objective To compare the effects of dot immunogold label filtration assay(DIGFA) and indirect immune fluorescent assay(IIF) in detecting the anti-dsDNA antibody. Methods Serum samples of 2 100 from outpatients and inpatients including 155 samples from 118 SLE inpatients and 44 samples from 44 RA inpatients were tested for ANA with IIF and anti-dsDNA antibody with IIF and DIGFA. Results The positive rates of anti-dsDNA antibody with DIGFA and IIF in 2 100 samples, SLE and RA inpatients were 9.86% vs 4.71%, 54.24% vs 35.59% and 2.27% vs 0% respectively. The positive rates of anti-dsDNA antibody with DIGFA in 3 groups were higher than those with IIF. The coincidence of two methods in 2 100 samples, SLE and RA inpatients was 94.95%, 77.97% and 97.73% respectively. Compared to IIF, the sensitivity and specificity of DIGFA were 91.92% and 94.20% in 2 100 samples. Anti-dsDNA antibody with DIGFA was still positive in 16.36% of 2 100 samples and 25.92% SLE inpatients when it became to the negative with IIF. Conclusion DIGFA used in the detection of anti-dsDNA antibody is faster and more sensitive than IIF and it dose not require any large equipment. The positive of anti-dsDNA antibody using DIGFA will contribute to the retrospective diagnosis of SLE. IIF can be replaced and supplemented by DIGFA.
MeSH DNA； antibodies/analysis；gold colloid；immunoblotting
作者簡(jiǎn)介：汪國(guó)生，男，35歲，主治醫(yī)師；李向培，女，44歲，主任醫(yī)師,安徽省風(fēng)濕病學(xué)會(huì)主任委員
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4，蘭小鵬，黃俏佳，涂向東 等. 快速斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測(cè)抗雙鏈DNA抗體. 中華皮膚科雜志，1997;30（1）:49～50
5侯麗燕，陳 燕，何曉琥 等. 抗dsDNA抗體兩種檢測(cè)方法的比較. 風(fēng)濕病學(xué)雜志，1997;2（4）:30～32
2000-02-24收稿
2000-06-16修回
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