免疫是機體維持健康的重要機制。有別于動物直接在血液中產生免疫反應，植物由于沒有完善的循環系統，植物免疫系統的基礎是植物的每個細胞。
經典的植物免疫系統包含PTI(PAMP-triggered immunity)，ETS(Eeffector-triggered susceptibility)和ETI(Effector-triggered immune)三個過程。第一階段，植物的模式識別受體(pattern-recognition receptors, PRRs)通過識別病原體上的一些共有的、保守的分子基序(pathogen associated molecular patterns, PMAPs)從而觸發的植物免疫反應；第二階段，病原向植物內注射效應因子(Effector)抑制植物PTI使病原能夠在植物細胞內繁殖；第三階段，植物通過NBS-LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat)基因來對抗病原Effector，引起一系列級聯反應，最終阻止病原進一步擴散。
下面我們就通過一篇成功案例（南京農業大學植物保護學院牛冬冬老師最新研究）來了解一下轉錄組測序在植物免疫研究的應用。
中文名: 蠟樣芽胞桿菌AR156誘發的擬南芥對丁香假單胞菌的免疫反應與flg22誘發免疫反應類似
英文名: Bacillus cereus AR156 Activates Defense Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana Similarly to flg22
雜志: Molecular Plant-Microbe Interactions, 2018
影響因子: 4.332
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研究背景
flg22是一種研究較多的PAMP，是對細菌運動極其重要的鞭毛蛋白，其N末端包含22個高度保守的氨基酸。FLS2特異識別flg22后激活下游免疫反應，包括激活MAPK信號途徑和抗性相關基因表達，ROS，胼胝體沉淀等。已有研究表明，flg22激活的免疫反應受到SA信號通路的正調控JA信號通路的負調控。丁香假單胞菌(Pseudomonas syringae pv. Tomato, pst)產生的冠菌素(coronatine, COR)可以激活JA信號通路抑制SA信號通路，從而抑制flg22的免疫反應。
該研究組之前的研究發現蠟樣芽胞桿菌AR156處理會促進擬南芥對pst的抗性。有趣的是，AR156處理和flg22處理都會抑制PTI重要的信號分子miR398b和miR773。基于此，對AR156激發的PTI反應是否與flg22的作用機理一致，本研究進行了深入的研究。
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材料與方法
1.實驗材料：四周的野生型擬南芥苗，分別用5*10∧7 CFU/ml AR156，1 μM flg22和水處理葉片，收集處理24小時后收集葉片提取RNA，每一組設置2個生物學重復，每個生物學重復至少10株苗混樣，共測序6個樣品。
2.測序方法：轉錄組測序，測序平臺為北京百邁客生物科技有限公司Illumina HiSeqX Ten。
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研究結果
1. 表型分析：AR156誘導植物對抗性
對野生型擬南芥苗分別先用5*107 CFU/ml AR156，1 μM flg22和水處理葉片，再于24小時后接種pst。結果如下圖，AR156和flg22處理均減少了病變程度和細菌種群密度，表明AR156和flg22都可以讓葉片對pst產生抗性。
圖1 AR156處理后的WT擬南芥對Pst有抗性
2.AR156誘導PTI的機制
為研究AR156誘導PTI的分子機制，該研究組比較分析了AR156與flg22處理后的葉片。處理24h后，AR156處理組和flg22處理組均出現明顯胼胝體沉淀和H2O2積累現象；同時，PAMP響應的重要基因PR1, FRK1, WRKY22, WRKY29, MPK表達均顯著上調。表明AR156和flg22在誘導PTI過程中有明顯的一致性。
3.AR156誘導的pst抗性依賴于AGO1和DCL，但不依賴于FLS2，SA, JA和ET
通路
結合突變體qPT-PCR結果、表型研究結果及細菌種群密度結果，研究AR156誘導的pst抗性對重要信號通路和miRNA結合蛋白的依賴性。
如圖2A、2B所示，AR156或flg22處理后顯著減少了病變的表型和細菌種群密度，但是不同處理在不同材料間沒有顯著差異；AR156和flg22處理后pst抗性也沒有顯著差異。由此可見，AR156誘導的pst抗性不依賴于SA-, JA-, and ET介導的信號通路，而FLS2作為flg22的受體，對響應pst是必不可少的。如圖3C和3D所示，AR156處理2天后，病變表型顯著減少。fls2苗在AR156處理和flg22處理分別處理后，前者病變表型顯著減少后者沒有。由此可見，AR156誘導的pst抗性不依賴于FLS2通路。
如圖3C和3E所示，AR156處理和flg22處理在WT和ler中病變表型顯著減少并且細菌種群密度下降100倍，而突變體ago1-27和dcl1-9中病變表型變化和細菌種群密度均無明顯變化。由此可見，AR156誘導的pst抗性依賴于AGO1和DCL。
圖2 AR156誘導的抗性不依賴于SA，JA，ET，FLS2信號通路，但需要AGO1和DCL蛋白；AR156和flg22誘導的抗性不依賴于SA，JA，ET信號通路
4.AR156和flg22分別調控miRNA的表達起作用
AR156處理和flg22處理后，檢測已經報道的與PTI相關的重要miRNA的表達量，除miR398b外，所有miRNA均上調表達miR158a, miR160a, miR167, miR169, miR391, miR393和miR396。鑒于miRNA對下游靶基因有重要調控作用，本研究繼續研究了上述miRNA的靶基因表達情況，結果表明miR158a, miR160a, miR167, miR391, miR393和miR396的靶基因顯著下調，miR398b和miR773的靶基因顯著上調，miR169靶基因處理前后無顯著變化。由此可見，AR156處理和flg22處理后均有miRNA調控的基因表達量變化，但兩者的通路中參與的miRNA不同。
5.AR156和flg22調控相似的轉錄模式
為了研究基因的表達模式，本研究也做了轉錄組測序。flg22, AR156和水處理后24h的樣品進行測序。FDR≤0.05且FC≥1為標準篩選1,302個差異表達基因(DEGs)，AR156處理和flg22處理分別有128和1,291個DEGs，共有的為117個，對DEGs的層次聚類分析見圖3B。KEGG注釋分析表明共有的117個DEGs的 KEGG注釋分類大部分信號通路與代謝過程相關，苯丙醇生物合成和苯基丙氨酸代謝通路在植物免疫過程中起重要作用，氨基和核苷糖代謝，半乳糖代謝，戊糖和葡糖醛酸轉換，淀粉和蔗糖代謝與植物細胞壁形成有關，如圖3C所示。
如圖3D所示，用1,302個DEGs 計算AR156處理、flg22處理和水處理兩兩之間的相關性，結果表明即使AR156處理和flg22處理分別的DEG差別很大，但AR156處理和flg22處理具有較高的一致性(0.76)。
本研究中，用qRT-PCR驗證AR156處理和flg22處理中都上調表達的10個基因和都下調表達基因的6個基因的表達量，驗證結果與轉錄組測序結果一致，如圖6A和6B 。
圖3 flg22, AR156，水(the control)處理24h后轉錄組測序
研究亮點
1. 本文的實驗材料較為豐富，觀察了多個重要通路突變體材料的病變表型及細菌種群密度。
2. 轉錄組數據分析方面，很好地關注和展現了差異表達基因(DEGs)的KEGG注釋通路；從整體差異表達的趨勢和差異表達注釋結果來關注兩種處理后轉錄組層面的響應情況。
3. 對轉錄組測序結果進行了qRT-PCR。
參考文獻
Wang S., Zheng Y., et al. (2018). Bacillus cereus AR156 Activates Defense Responses to Pseudomonas syringae pv. tomato in Arabidopsis thaliana Similarly to flg2. Molecular Plant-Microbe Interactions.
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