專家簡介
上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院感染科主任醫師、教授、博士生導師。現任感染病與呼吸病研究所所長、臨床病毒研究室主任，瑞金醫院北院副院長；兼任中華醫學會肝病學分會常委兼秘書、上海肝病學分會副主任委員、中法生命科學與基因組研究中心課題組負責人，國際法語地區熱帶病研究院理事會理事，法國科學院中法基金會博士后俱樂部主席。
文章來源
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俞曉琦,張欣欣.從病毒學角度談慢性乙型肝炎的功能性治愈[J]. 中華臨床感染病雜志,2018,11(4):269-274.
DOI:10.3760/cma.j.issn.1674-2397.2018.04.004.
【摘要】通過抗病毒治療達到慢性乙型肝炎（CHB）的功能性治愈已成為國內外研究的熱點和難點，近年來對其臨床治愈的標準也基本達成了共識：血清HBV DNA低于檢測下限，持續的HBsAg消失，伴或不伴抗-HBs血清學轉換，肝細胞內cccDNA處于非活動轉錄狀態，停止抗病毒治療后沒有疾病復發的情況。現有的抗病毒治療方案能有效抑制病毒復制，但難以達到CHB的功能性治愈。從病毒學方面考慮，乙型肝炎病毒（HBV）cccDNA的轉錄活性不能得到有效的抑制及病毒基因組DNA的整合導致HBsAg的持續表達是CHB患者功能性治愈率較低的兩大根本原因。此外，HBV獨特的復制周期產生的高頻突變也會導致表面抗原清除率的降低。本文將著重圍繞病毒學方面的研究現狀，探討功能性治愈CHB的新進展和新策略。
【關鍵詞】肝炎，乙型，慢性；功能性治愈；肝炎病毒，乙型；肝炎表面抗原，乙型；共價閉合環狀DNA
【Abstract】Functional cure of chronic hepatitis B (CHB) through antiviral therapy is the goal and main focus of research worldwide. The criteria of functional cure of CHB are undetectable serum HBV DNA, persistent loss of HBsAg, with or without anti-HBs seroconversion, persistence of cccDNA in a transcriptionally inactive status and the absence of spontaneous relapse after treatment cessation. Current antiviral therapy can effectively control viral replication, but is still quite far from achieving functional cure. From the virological point of view, HBV cccDNA reservoir and its transcription activity can hardly be inhibited by the existing antiviral therapy, and the integration of viral genomic DNA leads to the continuous expression of HBsAg, which are the two main causes of the low functional cure rate in CHB patients. Furthermore, the high frequency of viral mutation can also result in a reduction of HBsAg loss. This article reviews the new strategies and advances about functional cure of CHB based on the virology research.
【Key words】Hepatitis B, chronic；Immunity, innate；Immunity, humoral；Adaptive immunity；Functional cure
乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus, HBV）是一種威脅全球人類健康的病毒。根據已公布的統計數據推算，目前我國人群的HBsAg攜帶率約為6.1%，HBV感染者約8 600萬[1]。慢性乙型肝炎（Chronic hepatitis B，CHB）患者發生肝硬化和肝癌的風險較高，對達到治療標準的患者進行抗病毒治療則能減緩疾病的進展并減少肝臟相關疾病的發病風險[2]。乙型肝炎的功能性治愈是目前國內外公認的抗病毒治療的理想終點，本文將結合HBV復制的特點，著重圍繞病毒學方面的研究，就CHB功能性治愈的定義、難點及其重要性等問題進行探討。
一、CHB功能性治愈的定義
CHB真正意義上的完全治愈需要徹底清除所有被感染的肝細胞中的共價閉合環狀DNA（cccDNA），并且能夠在停止抗病毒治療后不出現因機體失去免疫控制而產生病毒再激活和疾病復發的風險[3]。現有的抗病毒治療方案很難做到徹底清除cccDNA，同時cccDNA只存在于被感染的肝細胞中，需要通過有創的肝活檢才能加以檢測，血清中缺乏明確的生物標志物來反映肝內的cccDNA的水平及其轉錄活性[4]。基于上述情況，有學者提出了“功能性治愈”的概念。目前，國際上較為公認的功能性治愈的定義是：血清HBV DNA低于檢測下限，持續的HBsAg消失，伴或不伴抗-HBs血清學轉換。肝細胞內cccDNA處于非活動轉錄狀態，停止抗病毒治療后沒有疾病復發的情況[3]。近年來，臨床治愈CHB，即實現功能性治愈已成為國內外抗病毒治療較為可行的理想終點，并以此作為指導臨床安全停藥的標準。
二、HBV復制周期及其特點
HBV是一種獨特的DNA病毒，其復制需要前基因組RNA中間體來完成。HBV感染肝細胞時，通過與肝細胞相關受體鈉離子-牛磺膽酸共轉運蛋白（NTCP）結合并穿入細胞后釋放核衣殼[5]，其基因組部分環狀雙鏈DNA即rcDNA進入細胞核，補齊雙鏈缺口形成cccDNA[6]。HBV cccDNA與宿主組蛋白和非組蛋白結合形成病毒微染色體，具有高度穩定性[7]，作為轉錄模板產生3.5×103 bp的前基因組RNA和PreC mRNA，2.4×103 bp的PreS1 mRNA，2.1×103 bp的PreS2/S mRNA及0.7×103 bp的HBx mRNA[8]，分別編碼聚合酶和核心蛋白，可溶性抗原，表面抗原大、中、小蛋白和HBx蛋白。前基因組RNA還可作為病毒逆轉錄的模板，通過與核心蛋白和聚合酶的結合，開始病毒的裝配，并開始逆轉錄過程。
病毒聚合酶與前基因組RNA 5’端Epsilon環結合并以之為模板合成3～4個寡核苷酸，發生第一次模板轉位到前基因組RNA 3’端的DR1上配對，沿3’至5’端方向合成負鏈DNA。延伸至前基因組RNA 5’端時，聚合酶會切除RNA并余10～16個核苷酸作為引物，發生第二次模板轉位到負鏈DR2上，沿負鏈3’至5’端方向合成正鏈DNA。延伸至負鏈5’端DR1結構時發生第三次模板轉位，跳轉到環化負鏈的3’端DR1結構繼續合成正鏈DNA，并最終形成rcDNA[9]。成熟的病毒顆粒獲得包膜蛋白向胞外釋放，一部分則會返回至細胞核中轉變為cccDNA，保持一定數量的轉錄模板。
HBV感染的過程中還會產生病毒基因組DNA的整合，但這并不是病毒復制所必需的過程。當病毒復制過程中RNA引物的第二次模板轉位失敗，在原位引發正鏈合成，就會形成雙鏈線性(DSL)DNA，在宿主細胞酶的作用下，病毒雙鏈線性形式的DNA就會整合至宿主DNA中[10]。此前認為HBV基因組的整合與肝細胞肝癌相關[11]，現階段研究發現，病毒的整合是一個隨機事件，可發生在CHB感染的早期。與病毒感染的HBeAg陽性階段相比，HBeAg陰性階段發生的整合事件數量明顯更多[12]。
三、CHB功能性治愈的難點
國內外多推薦將功能性治愈作為CHB抗病毒治療的理想終點，代表患者已獲得持久的病毒學抑制和免疫學控制，但現階段仍只有小部分CHB患者在接受抗病毒治療后獲得臨床治愈，提高功能性治愈率可謂難點重重。從病毒學方面考慮，接受長期抗病毒治療后，CHB功能性治愈率仍然較低的可能原因如下：首先，cccDNA存在微染色體中，難以被現有的抗病毒藥物徹底清除，其具有轉錄活性并作為病毒持續復制的模板；其次，病毒基因組DNA整合至宿主DNA中，可持續產生HBsAg。
1.現有的抗病毒藥物對HBV的清除作用
目前針對CHB有效的抗病毒治療藥物包括聚乙二醇干擾素（Peg IFN）及核苷（酸）類似物（NAs）[13]。這些藥物通過免疫調節作用和直接抗病毒作用抑制病毒的復制，減輕肝臟的病理損害，但長期治療后HBsAg的陰轉率仍然較低[4]。NAs主要針對病毒復制的逆轉錄過程，能有效抑制病毒的復制，降低外周血病毒載量，對cccDNA沒有明顯的抑制效果[14]，長期治療后血中的HBsAg下降亦不明顯。因此，單用NAs不能有效達到功能性治愈CHB的目的。IFN作為免疫調節劑，能夠產生多種抗病毒物質，其抑制病毒復制的效果不如NAs快和強，但較為持久，延長治療時間則可能會帶來更多的不良反應。根據長期隨訪數據顯示，在接受IFN治療后也僅有10%～13%的人群發生HBsAg的清除[15]。值得注意的是，在接受IFN治療后，基因型為A型或B型的患者較C型和D型的患者有更高的HBsAg清除率[16]。有關聯合使用Peg IFN及NAs是否能有效提高CHB功能性治愈率的意見尚不一致[17]，多數研究認為聯合治療比單藥治療在HBsAg清除方面有一定優勢，但并未改善停藥后的持久應答率，也有學者認為聯合治療并不能提高功能性治愈率[18-19]。
2.根據病毒復制特點尋找新的治療靶點
現有的抗病毒治療方案不能提供理想的功能性治愈率，所以有必要研發新的抗病毒藥物，以提高功能性治愈率[20]。根據HBV獨特的生活史，可從抑制HBV進入肝細胞，降解消除cccDNA或抑制HBV的產生，抑制HBsAg釋放等過程尋找新的抗病毒治療靶點[21]，以改善CHB人群的功能性治愈率[22]。
四、HBV cccDNA的表觀遺傳調控及其病毒學替代指標
CHB難以治愈的主要原因之一就是抗病毒治療后無法有效清除作為病毒轉錄模板和基因組保存形式的cccDNA。獲得臨床完全治愈要求CHB患者肝細胞內的cccDNA被徹底清除，而獲得功能性治愈的患者肝細胞內仍可以有cccDNA的存在，但必須處于非轉錄活性狀態[23]。為了達到理想的功能性治愈率，對病毒cccDNA的控制顯然是一項重要的研究議題。
1. HBV cccDNA的生物學特點
現有的研究發現cccDNA的半衰期較長，通過推算至少需要14.6年才能完全清除肝細胞內存在的cccDNA[24]，其在肝細胞內的持續存在是CHB久治不愈和停藥后容易復發的主要原因[25]。HBsAg得到清除后，肝細胞內仍能檢測到cccDNA的存在。在cccDNA形成后，Peg IFN能靶向抑制其轉錄機制，如轉錄因子和染色質修飾酶等，減少病毒蛋白和病毒顆粒的產生，所以部分患者使用Peg IFN能達到功能性治愈的目的[26]。
2. HBV cccDNA的表觀遺傳調控
實驗證據表明，HBV cccDNA通過與宿主組蛋白和非組蛋白結合并得到修飾而穩定存在[24]，其表觀遺傳修飾有助于病毒的復制和感染的慢性化。表觀遺傳調控主要包括DNA的甲基化，組蛋白的翻譯后修飾等。DNA的甲基化通常會導致基因的轉錄沉默狀態，HBV cccDNA的甲基化會導致病毒基因表達下降[27]，這一過程可作為新的CHB抗病毒治療策略。與HBV cccDNA結合的組蛋白通過翻譯后修飾（PTMs）的各種組合可促進或抑制基因的表達，例如H4組蛋白精氨酸3的對稱二甲基化（H4R3me2s）與轉錄抑制有關[28]，精氨酸甲基轉移酶PRMT5可誘導與cccDNA結合的H4R3me2s，從而抑制病毒的轉錄活性，表明靶向cccDNA表觀遺傳治療的可能性。
根據現有的研究結果，表觀修飾對cccDNA的持續存在和清除過程發揮了重要作用。如果能通過表觀修飾沉默cccDNA的轉錄活性，可作為控制CHB的一項手段，甚至能提高CHB的臨床治愈率。
3. 反映肝內cccDNA及其轉錄活性的病毒學替代指標
由于肝細胞核內的cccDNA無法釋放到血循環，在臨床實踐中，如何監測cccDNA的水平及其轉錄活性仍是一項重大的挑戰。為了更好地了解患者在抗病毒治療后是否獲得功能性治愈，需要發現新的病毒學無創標志物來替代傳統的肝活檢檢測cccDNA的手段[29]。血清中的HBsAg曾作為肝內cccDNA的替代標志物，但近期的研究結果發現，經過長期的NAs治療后（均值126周），患者肝內cccDNA可被大量消耗并顯著降低，有49%低于檢測下限，而外周血中仍能檢測到HBsAg的存在[26]，提示HBsAg并非反映肝內cccDNA情況的最佳病毒學標志物，原因可能是HBsAg可來自整合的HBV基因組DNA。
近期有不少病毒學指標被發現可能具有反映肝內cccDNA轉錄活性的價值，如血清HBV RNA。血清HBV RNA樣病毒顆粒中主要是3.5×103 bp的前基因組RNA[30]。不同于HBsAg，由于病毒基因組DNA長度不超過3.2×103 bp，血清中的HBV RNA僅源自肝內的cccDNA，不能通過整合的HBV基因組轉錄所得，因此是反映肝細胞內cccDNA轉錄活性的良好標志物[31]。有學者還據此提出了從“部分治愈”，“準臨床治愈”再到“臨床治愈”的階梯性提升模式[32]，對血清HBV RNA在功能性治愈中的應用價值進行了展望。
五、HBsAg與HBV基因組整合
HBsAg的清除是獲得功能性治愈的另一個重要標準。乙型肝炎研究中最早被發現的就是HBsAg，也是HBV感染后最難清除的病毒蛋白，包括大、中、小三種類型[33]，除了形成具有感染性的丹氏顆粒（Dane顆粒）外，還組成大量的亞病毒顆粒，即管狀或小球形顆粒[34]。其中HBsAg大蛋白和宿主細胞的NTCP受體具有高度親和力，是病毒進入細胞重要的蛋白。乙型肝炎感染者的血清中以亞病毒顆粒為主，其數量遠超Dane顆粒。既往研究認為，非感染性亞病毒顆粒的大量存在降低了病毒顆粒被HBsAg中和的機會，誘導免疫耐受，賦予了病毒生物學優勢。鑒于HBsAg是宿主免疫應答清除病毒過程中的重要靶抗原的這一理論依據，國內有團隊設計了HBsAg-HBIG復合物型治療性疫苗“乙克”，以HBsAg為突破口，誘導患者的持久免疫，從而使cccDNA處于非轉錄活性狀態，達到功能性治愈[14]。
近期有關HBsAg分子病毒學方面的研究讓我們對其與cccDNA和整合的HBV基因組DNA之間的相互關系有了更深的理解[12]。血循環中的HBsAg既可來自cccDNA，也可來自整合的HBV基因組DNA。整合至宿主的病毒基因組片段缺少核心蛋白的啟動子和增強子，不足以成為病毒復制的模板，但大部分整合的片段含有HBsAg的啟動子區域，因此在cccDNA得到清除或受到表觀修飾失去轉錄活性時，HBsAg仍能在細胞中進行表達[35]。研究顯示，HBeAg陰性患者體內整合的DNA片段是HBsAg的重要來源，故經過長時間的抗病毒治療，CHB患者血清HBsAg仍可持續陽性[36]。因此，達到HBsAg陰轉需要同時清除cccDNA及整合的病毒基因組DNA或阻斷其的表達。不難推測，發生病毒整合的患者清除HBsAg的可能性要比無整合者小很多，但整合來源的HBsAg表達并不意味著病毒在肝內的活躍復制，這對定義臨床治愈和考慮HBsAg陽性的患者是否能進行安全停藥是一個重要的問題。整合產生的HBsAg是否具有病毒學功能和致病性尚不明確，針對整合的片段進行治療的必要性也是一個有待解決的議題。
六、HBV基因突變與HBsAg清除
HBV自身具有高度變異性，這些變異與抗病毒療效之間的關系也是研究的熱點之一。HBV PreS/S區的突變可改變HBsAg抗原表位，影響抗原抗體反應的親和力和病毒顆粒的包裝、分泌及感染性等。一項研究結果顯示，HBsAg特定糖基化位點的突變可介導免疫逃避[37]，患者外周血呈現HBsAg和anti-HBs的共存。也有研究發現，HBsAg St123N的突變能夠減少病毒的分泌，誘導HBsAg和抗體更強的免疫反應，加速HBsAg在體內的清除[38]。部分患者在經過治療后出現了HBV PreS/S區的突變，表現為外周血HBsAg的陰轉，但并不代表病毒的清除[39]，影響抗病毒療效的評估。
目前，二代測序技術被廣泛用于檢測病毒變異體。一項研究運用了高通量測序技術分析了157例患者的病毒基因組序列，檢測到具有BCP/PC變異體或更高病毒多樣性的患者在接受長期NAs治療后發生HBsAg陰轉的概率更低[40]。因此，HBV感染達到功能性治愈的治療策略也應考慮到患者的BCP/PC序列特異性。
七、小結
從病毒學方面考慮，由于HBV cccDNA不能通過現有的抗病毒藥物抑制其轉錄活性，作為病毒持續復制的模板，導致現階段CHB人群中的功能性治愈率較低。此外，病毒基因組DNA的整合能夠表達HBsAg，導致絕大多數患者在抗病毒治療后HBsAg的清除率較低，而這恰好是臨床治愈的標準之一。CHB患者停藥時HBsAg得到清除或達到功能性治愈，肝細胞肝癌的發生率顯著降低[41]。因此，針對病毒的復制環節研發新的抗病毒藥物迫在眉睫，有效的cccDNA病毒學替代指標也有待被發現和證實，使CHB患者通過有限的治療更早清除HBsAg，提高功能性治愈率。
