近年來聯(lián)合多組學分析已經(jīng)成為表觀領(lǐng)域的研究熱點，利用單一組學數(shù)據(jù)分析致病因子的局限性愈發(fā)顯著。通過多組學聯(lián)合分析將有助于人們更加系統(tǒng)全面的認識腫瘤的生物學行為，進一步為尋找有價值的腫瘤標志物和探討腫瘤相關(guān)機制提供新的線索。這篇NC文章聚焦在了肝癌這個腫瘤上面，看看組學分析能夠得到什么有意思的發(fā)現(xiàn)呢？
作者從以轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)入手，結(jié)合基因組數(shù)據(jù)和表觀數(shù)據(jù)進行差異分析。看能不能找到與肝癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的異常基因或者是通路。
主要研究思路和結(jié)論是：
1.分析64個肝癌病人樣本，通過尋找DNA甲基化（MET cor）和DNA拷貝數(shù)變異（CNV cor）差異表達基因，證明了異常的MET cor和CNV cor的基因有些顯著的共調(diào)控作用。
2.進一步研究，能否根據(jù) MET cor和CNV cor進行肝癌分型，將已有的肝癌樣本分為三個亞型。并且在TCGA數(shù)據(jù)庫中進行驗證（NMF算法）
3.篩選對HCC侵襲性影響最大的基因變異BAP1，對腫瘤的侵襲有著至關(guān)重要的作用，而且在 Huh7細胞轉(zhuǎn)染實驗進行驗證
帶著問題去思考：
1：為什么選擇肝癌？
2：作者是怎樣找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數(shù)變異的基因的？
3：如何去證明這些基因的共調(diào)控作用呢？既然共調(diào)控，調(diào)控的機制是什么？（或者是說如何去聯(lián)系DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的？）
4：是如何對肝癌進行分型的呢？分類結(jié)果如何顯示呢？怎么驗證？
5：如何篩選功能最顯著表達差異的基因（如何篩選到BAP1?）
1:DNA甲基化和拷貝數(shù)變異發(fā)生在腫瘤的侵襲中
2：肝癌是重大公共衛(wèi)生問題，中國尤甚；同時對于肝癌來說，基因組和表觀組的異質(zhì)性大，簡單介紹一下今天的主角：肝細胞癌（Hepatocellularcarcinoma， HCC），全球惡性癌癥死因“惡名榜”第二。中國是HCC的重災(zāi)區(qū)，不僅“貢獻”50%的全球HCC新發(fā)和死亡病例，且平均年齡55-59歲比國外HCC低發(fā)國家早近20年[1,2,3]。
3：在之前的研究中，一些癌癥相關(guān)的基因通過DNA甲基化去發(fā)揮功能作用，如 IGF2 UHRF1這些基因
4：收到DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的影響，既然都可以影響轉(zhuǎn)錄，那么他們之間有沒有協(xié)同作用呢？這方面的研究還不是很清楚
5：一共用了64個肝癌的CNV,MET,EXP樣本信息
(DNA甲基化和拷貝數(shù)變異會導致轉(zhuǎn)錄失調(diào))
b.在a圖的基礎(chǔ)上，需要找到差異顯著的那些基因，然后|r|>0.5，也就是紅圈圈的位置，然后發(fā)現(xiàn)了CNVcor有813個，METcor有321個。把這幾個基因集進行求交集發(fā)現(xiàn)了只有24個overlap基因.
ps:拿到這些基因做了一個富集分析，發(fā)現(xiàn)CNV差異基因富集在蛋白相關(guān)的信號通路上，MET的差異主要富集在炎癥反應(yīng)等上面
c. CNV基因顯示出了它的一個基因組偏好性，比較集中在8號染色體上。DNA甲基化的基因在全基因組上分布沒有偏好性。
d.（左圖） 發(fā)現(xiàn)DNA甲基化的基因一般都分布在inter-genic(基因間區(qū))而不是CpG島。（右圖）發(fā)現(xiàn)DNA甲基化更偏向于發(fā)生在基因body區(qū)域，推測開放區(qū)域的甲基化可能會導致轉(zhuǎn)錄異常，芯片中CpG島的表達方式N_shore,N_shelf等。
e:計算每個病人樣本的CNVcor上調(diào)和下調(diào)的基因個數(shù)，METcor上調(diào)和下調(diào)的個數(shù)。然后畫出e的柱狀圖。（不同顏色代表上下調(diào)的基因）下面那個熱圖的意思就是說紅色的上調(diào)的，藍色的是下調(diào)的基因位點。
f:去尋找CNVcor上調(diào)和下調(diào)基因和METcor上調(diào)和下調(diào)的相關(guān)性。每個點代表著一個病人樣本。橫縱坐標代表這個病人的差異基因的個數(shù)，然后做了一個相關(guān)性分析。
Q:這整個一個大Figure說明了什么？
A:個人認為是確定DNA甲基化和拷貝數(shù)變異適合轉(zhuǎn)錄組異常相關(guān)的，至于有多么相關(guān)，數(shù)據(jù)給出信息。
對于CNV和MET差異表達基因可以用于肝癌的分子分型
【這是無監(jiān)督學習算法的一種，和k-mean，分層聚類等目的一樣，為了把這些樣本進行分類。感興趣的可以看看：
https://blog.csdn.net/google19890102/article/details/51190313】對CNV和MET基因進聚類，然后得到的結(jié)果，OS 是overall survival（總體生存時間），TTR是time to tumor recurrece（腫瘤復發(fā)時間）。發(fā)現(xiàn)對于CNV分類來說可以把這些樣本分成3類，用MET分類的話可以分成4類。而且從分類效果OS,TTR來看CNV的分類效果更好。
【iCluster：一種可以利用R包進行分類的分類方法，詳情可以見：http://www.bioconductor.org/packages/devel/bioc/html/iClusterPlus.html】
c:熱圖顯示了iCluster分析鑒定的亞型表達模式。使用NMF聚類方法鑒定的CNVcor或METcor基因的亞型的比較，每個亞型鑒定的結(jié)果用彩色條形標記。每個亞型中CNVcorup、CNVcordown、METcorup、METcordown 基因的異常表達頻率如圖(最底下)所示。中間的是熱圖。
d:用K-Mean的方法畫出利用icluster方法分類的這種類型的OS,TTR曲線，看看分類效果。
【作者比較了iCl1，iCl2和iCl3亞組的臨床病理特征，發(fā)現(xiàn)iCl1腫瘤比iCl2或iCl3的侵襲性更強（P = 0.002，表1）。 其他臨床特征在亞組之間沒有差異。 這些結(jié)果與分子亞型的獨特侵襲性特征一致。 基于這些發(fā)現(xiàn)，CNVcor和METcor基因的綜合分析可以識別分子亞型，每個分子亞型具有與轉(zhuǎn)錄失調(diào)相關(guān)的基因組和表觀基因組特征的不同組合，與不同的預(yù)后結(jié)果相關(guān)。】
Q：得到了這個分類結(jié)果，相當于一個訓練集，那么如何驗證這個訓練集的分類效果呢？
A：利用數(shù)據(jù)庫，大樣本庫的數(shù)據(jù)進行驗證
Validation of the molecular subtypes in an TCGA data set.png
a:觀察到CNV和轉(zhuǎn)錄組之間的相關(guān)系數(shù)的總體分布向右偏，MET左偏，
b,c:尋找差異的基因，求交集，發(fā)現(xiàn)CNVcor基因在8號染色體進行富集和之前一致
d.e: METcor基因在open sea區(qū)域和gene body域比在CpG島和TSS區(qū)域富集更頻繁 此外，異常CNVcor和METcor基因的頻率之間的相關(guān)性也得到驗證，相關(guān)性0.82.
f,g :分類效果，C1組DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化畸變率最高，C3組最低
h：OS,RFS分析圖
Q:發(fā)現(xiàn)利用CNV和DNA甲基化是可以用作分子分型的，大樣本也重復出來了結(jié)果，接下來如何分析呢？如何去找DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的關(guān)系呢？
A:我們接下來看看作者如何借助統(tǒng)計學去試圖尋找答案
整合DNA甲基化數(shù)據(jù)和拷貝數(shù)變異數(shù)據(jù)
圖a,b整合了TCGA的數(shù)據(jù)和他們自己已有的數(shù)據(jù)進行分析。
CNV gain的頻率與CNV loss的頻率顯著正相關(guān)（r = 0.43，P = 1.5×10-20，圖4a）。 相反，MET gain的頻率與MET loss的頻率呈負相關(guān)。
在C圖中，我們可以看到橫坐標是CNV頻率，縱坐標是 MET頻率，可以看出他們有顯著的相關(guān)性
在圖d,e,f,g中，分別以CNV gain ,CNV lose，MET gain ,MET loss進行坐標變換。然后都發(fā)現(xiàn)他們的之間的相關(guān)性與橫縱坐標軸的變量變化無關(guān)。
總之，我們認為頻繁的DNA拷貝數(shù)異常的HCC患者更可能經(jīng)常出現(xiàn)DNA甲基化異常。 異常CNVcor和METcor基因的這些相關(guān)頻率可能意味著DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化的異常之間的密切關(guān)系。
a:TCGA中肝癌的數(shù)據(jù)樣本分析，剔除了同義突變后，篩選出在189個發(fā)生10次以上突變的重復突變基因，我們鑒定出37個差異突變基因，其中> 5%的突變頻率在C1、C2、C3亞型之間存在差異（其中有2個肝癌樣本沒有基因組突變數(shù)據(jù)），發(fā)現(xiàn)了BAP1是C1突變的最頻繁的基因。CTNB1是C2、C3當中突變最頻繁的基因，而且和腫瘤的發(fā)展高度相關(guān)
b:GeneMania軟件做的圖（基因間相互作用的，可以在cytocsape里面裝這個插件，也可以去分析網(wǎng)站GeneMANIA，網(wǎng)址：http://genemania.org），為了找到亞型的功能決定區(qū)域，利用SNU和TCGA數(shù)據(jù)交集CNVcor genes (n = 95) and METcor genes (n = 179)進行分析，發(fā)現(xiàn)了UBC 這個基因在CNV基因集中相關(guān)系數(shù)很高。（越靠中心說明了越重要）
c:先對這兩個基因集求一下交集，找到相同的差異的上調(diào)或者下調(diào)的基因。舉個例子來說：CA9是iCl1/C1腫瘤中上調(diào)表達差異最大的基因。（CA9是缺氧的一個標志物，其過表達在HCC中是一個不好的預(yù)后標志物。此外，與其他亞型相比，侵襲性iCl1和C1腫瘤表達了高水平的干細胞相關(guān)基因，如KRT19、EPCAM和PROM1。與Rhee, H等人報道的CA9的表達與HCC中干細胞相關(guān)表型相關(guān)的結(jié)果相符[4]。）
基于這個可能和干性有關(guān)的特性，進一步評估已知的和干性相關(guān)的基因集(即ESC、Nanog、Oct4、Sox2、Myc1、Myc2等已知的和細胞干性相關(guān)基因集)。在熱圖中，黃色代表高表達，藍色代表低表達，發(fā)現(xiàn)在IC1,C1中這些干性的基因集高表達了。說明和這些差異表達的基因和腫瘤干性有關(guān)系。
作者將這次分類結(jié)果與之前定義HCC亞型分子分型的研究進行了比較。發(fā)現(xiàn)二者overlap。這也意味著這些以前的分類的表達可能與CNVcor和METcor基因畸變的頻率有關(guān)。
（PS:腫瘤干細胞(CsC)理論認為腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和復發(fā)與CsC密切相關(guān),對CSC的研究已成為腫瘤研究的熱點。自我不斷的更新復制以及保持分化的潛能是干細胞的特性。Sox2、Nanog等轉(zhuǎn)錄因子是維持干細胞干性的核心轉(zhuǎn)錄因子，那么有關(guān)于這些轉(zhuǎn)錄因子的表達情況是作者探究肝癌細胞是否具有干性的核心關(guān)注點。）
綜上所述，這些發(fā)現(xiàn)提示，與DNA拷貝數(shù)和DNA甲基化相關(guān)的HCC分子亞型也與BAP1和CTNNB1突變有關(guān)，這可能在HCC亞型進展中發(fā)揮調(diào)控作用。對于分類結(jié)果來說，我們認為C1和iCl1腫瘤可能具有這些亞型的共同功能特征，如侵襲性或干性。我想知道為什么這里分析出兩個突變，后面只驗證了一個：因為C1是惡性程度最高的HCC，所以更關(guān)注BAP1，另外一個就不詳細研究。
d:展示了BAP1抑制對肝癌細胞干細胞基因表達的影響。Huh7細胞通過轉(zhuǎn)染以BAP1 shrna，下調(diào)BAP1的表達，發(fā)現(xiàn)了包括CA9、KRT19、EPCAM、PROM1在內(nèi)的stemness基因的顯著上調(diào)表達。這些結(jié)果有力地支持了我們的發(fā)現(xiàn)，即BAP1突變可能至少在一定程度上促進了一種侵襲性HCC亞型表達。
這篇文獻的主圖基本上就講到這里了。看完之后思考之前的問題：
1：為什么選擇肝癌？
因為肝癌在全球的發(fā)病率死亡率非常靠前，而且CNV和MET異質(zhì)性比較大。研究既有實際意義又有可行性。
2：作者是找到這些異常的DNA甲基化基因和拷貝數(shù)變異的基因的？
通過表達譜，找到差異位點進行分析。同時通過TCGA的樣本分析，也找到很多這種差異表達基因。
3：如何去如何起證明這些基因的共調(diào)控作用呢？既然共調(diào)控，調(diào)控機制是什么？（或者是說如何去聯(lián)系DNA甲基化和拷貝數(shù)變異的？）
通過尋找相關(guān)性,畫線形圖，找到相關(guān)性系數(shù)最大的進行比較。總體來說，通過自己的64個肺癌樣本+TCGA數(shù)據(jù)庫驗證，證明了CNVcor和METcor基因的頻率之間的相關(guān)性。
4：對肝癌進行分型是如何分的？分類結(jié)果如何顯示呢？
利用了非負矩陣分解，對CNVcor和METcor的基因進行分類得到結(jié)果C1,C2,C3。并且比較了這幾類的總體生存率和轉(zhuǎn)移率。
5：如何篩選功能最顯著表達差異的基因（如何篩選到BAP1?）
通過找到基因的突變頻率，然后發(fā)現(xiàn)了BAP1這個基因在C1里面突變的頻率是最多的，然后CTNB1在C3里面突變頻率更高。（ps:通過求兩個基因集的overlap進行熱圖分析，可以發(fā)現(xiàn)一些和干性相關(guān)的基因，并且進了實驗驗證）
文獻thinking:
1：首先樣本的數(shù)量60多對，感覺不是很多。而且作者在文章中也承認樣本量的問題會造成結(jié)果的偏差。（雖然TCGA數(shù)據(jù)庫驗證可以部分找補）
2：關(guān)于基因組分布的偏好性，作者并沒有給出一個合理的解釋。可以多往這個方面多挖掘一些信息。
3：還有一些點可以深挖掘，比如說找到了一下表達差異相關(guān)的基因，那么這些基因在表觀上有沒有其他的作用，（雖然有討論Bap1和H3K27me3的關(guān)系），比如說是不是和組蛋白修飾或者是ncRNA有關(guān)？
4：找到的這些significant基因當診斷的marker是否可行（或者治療靶點）？
5：DNA甲基化和CNV的相關(guān)性問題，既然找到了CNV_DOWN和MET_DOWN有正相關(guān)，圖一f中，是不是可以繼續(xù)挖下去呢？進一步解釋一下DNA甲基化和CNV之間的是如何影響的呢？畢竟文章只是說存在相關(guān)性。
參考文獻
原文鏈接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29018224
1：Torre LA, Bray F, Siegel RL, Ferlay J, Lortet‐Tieulent J, Jemal A. Global cancer statistics, 2012. CA Cancer J Clin. 2015;65:87‐108.
2：Hindupur SK, Colombi M, Fuhs SR, et al. The protein histidine phosphatase LHPP is a tumour suppressor. Nature 2018, 555, 678‐682.
3：MALEK NP, SCHMIDT S, HUBER P, et al. The diagnosis and treatment of hepatocellular carcinoma[J]. Dtsch Arztebl Int, 2014, 111(7): 101-106. DOI:10.3238/arztebl.2014.0101.
4: Rhee, H. et al. Poor outcome of hepatocellular carcinoma with stemness marker under hypoxia: resistance to transarterial chemoembolization. Mod. Pathol. 29,1038–1049 (2016)
排版：小丸子
文章來源于：sci666
