顯 微 鏡 知 識
我們的眼睛能看到數百萬光年外的星系，卻不一定能看到眼前細小的物體。在大尺度上觀察物質的運動，毫無疑問能得到強烈的美感。那么從極其微小的尺度上呢？威廉·布萊克在一首詩中寫道：
一花一世界，
一沙一天堂，
掌中握無限，
霎那成永恒。
——《天真的預言》（Auguries of Innocence），1863
如果除去其中的神秘主義和宗教意味，那么這首詩恰好與微觀世界的某些特點不謀而合。例如一朵花包含數以萬計的細胞，而一粒沙確實是由無數的氧原子和硅原子組成的(SiO2)。
不過，即使把一朵花握于掌中，你也決不會肉眼分辨出其中的“世界”。一個視力正常的人，只能看清大約25厘米之外的物體，如果繼續靠近，晶狀體就無法把物體的像正確的投影在視網膜上。即使在25厘米的明視距離上，你也只擁有1分的分辨率。或者說，在這個距離上，你恰好能把兩條相距0.075毫米的線分開。從生物學的角度可以解釋這種現象。當兩條線的距離小于0.075毫米的時候，它們的像就會落在視網膜的同一個視覺感受器——視錐細胞或者視桿細胞——上面。那么你就沒法把它們分辨開來。
很早以前，人們就知道某些光學裝置能夠“放大”物體。比如在《墨經》里面就記載了能放大物體的凹面鏡。至于凸透鏡是什么時候發明的，可能已經無法考證。凸透鏡——有的時候人們把它稱為“放大鏡”——能夠聚焦太陽光，也能讓你看到放大后的物體，這是因為凸透鏡能夠把光線偏折。你通過凸透鏡看到的其實是一種幻覺，嚴格的說，叫做虛像。當物體發出的光通過凸透鏡的時候，光線會以特定的方式偏折。當我們看到那些光線的時候，或不自覺地認為它們仍然是沿筆直的路線傳播。結果，物體就會看上去比原來大。
單個凸透鏡能夠把物體放大幾十倍，這遠遠不足以讓我們看清某些物體的細節。公元13世紀，出現了為視力不濟的人準備的眼鏡——一種玻璃制造的透鏡片。隨著籠罩歐洲一千年的黑暗消失，各種新的發明紛紛涌現出來，顯微鏡（microscope）就是其中的一個。大約在16世紀末，荷蘭的眼鏡商詹森（Zaccharias Janssen）和他的兒子把幾塊鏡片放進了一個圓筒中，結果發現通過圓筒看到附近的物體出奇的大，這就是現在的顯微鏡和望遠鏡的前身。
據說，幾百年前列文虎克把他制作顯微鏡的技術視為秘密。今天，顯微鏡——至少是光學顯微鏡——已經成了一種非常普通的工具，讓我們了解這個小小的大千世界。
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復合式顯微鏡
詹森制造的是第一臺復合式顯微鏡。使用兩個凸透鏡，一個凸透鏡把另外一個所成的像進一步放大，這就是復合式顯微鏡的基本原理。如果兩個凸透鏡一個能放大10倍，另一個能放大20倍，那么整個鏡片組合的的放大倍數就是10*20=200倍。
1665年，英國科學家羅伯特·胡克（人們可能更熟悉他的另一個發現：胡克定律）用他的顯微鏡觀察軟木切片的時候，驚奇的發現其中存在著一個一個“單元”結構。胡克把它們稱作“細胞”。不過，詹森時代的復合式顯微鏡并沒有真正顯示出它的威力，它們的放大倍數低得可憐。荷蘭人安東尼·馮·列文虎克（Anthony Von Leeuwenhoek ，1632-1723)制造的顯微鏡讓人們大開眼界。列文虎克自幼學習磨制眼鏡片的技術，熱衷于制造顯微鏡。他制造的顯微鏡其實就是一片凸透鏡，而不是復合式顯微鏡。不過，由于他的技藝精湛，磨制的單片顯微鏡的放大倍數將近300倍，超過了以往任何一種顯微鏡。
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羅伯特·虎克的顯微鏡
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列文虎克的顯微鏡
當列文虎克把他的顯微鏡對準一滴雨水的時候，他驚奇的發現了其中令人驚嘆的小小世界：無數的微生物游曳于其中。他把這個發現報告給了英國皇家學會，引起了一陣轟動。人們有時候把列文虎克稱為“顯微鏡之父”，嚴格的說，這不太正確。列文虎克沒有發明第一個復合式顯微鏡，他的成就是制造出了高質量的凸透鏡鏡頭。
在接下來的兩個世紀中，復合式顯微鏡得到了充分的完善，例如人們發明了能夠消除色差（當不同波長的光線通過透鏡的時候，它們折射的方向略有不同，這導致了成像質量的下降）和其他光學誤差的透鏡組。與19世紀的顯微鏡相比，現在我們使用的普通光學顯微鏡基本上沒有什么改進。原因很簡單：光學顯微鏡已經達到了分辨率的極限。
如果僅僅在紙上畫圖，你自然能夠“制造”出任意放大倍數的顯微鏡。但是光的波動性將毀掉你完美的發明。即使消除掉透鏡形狀的缺陷，任何光學儀器仍然無法完美的成像。人們花了很長時間才發現，光在通過顯微鏡的時候要發生衍射——簡單的說，物體上的一個點在成像的時候不會是一個點，而是一個衍射光斑。如果兩個衍射光斑靠得太近，你就沒法把它們分辨開來。顯微鏡的放大倍數再高也無濟于事了。對于使用可見光作為光源的顯微鏡，它的分辨率極限是0.2微米。任何小于0.2微米的結構都沒法識別出來。
暗視場顯微鏡
在日常生活中，室內空氣里的微粒灰塵是不容易看見的，但在黑暗的房間中，若有一束光線從門縫斜射進來，灰塵微粒便粒粒可見了，這就是光學上的丁達爾現象，這也是在白天我們不能而在夜晚就能清晰地看到天上星星的原因。暗視場顯微鏡 就是利用此原理設計的，觀察血細胞的清晰度比普通亮背景顯微鏡有了大大提高，以暗視 場顯微鏡所看到的是襯托在黑背景中發亮的細胞輪廓及其細節。顯微鏡的最高分辨率為0.2微米，而暗視場顯微鏡 能大大提高樣品的細節構造分辨率，可看到0.004微米以上微細顆粒的存在，即可以看到亞顯微結構，特別適合用來觀察微細的顆粒與細菌等。在醫學、林業、農業等眾多領域研究中有著廣泛用途。
暗視場顯微鏡觀察 相差顯微鏡觀察
相差顯微鏡
相差顯微鏡的基本原理是通過儀器，把透過顯微標本的可見光的相位差變成振幅差，從而大大提高了標本內顯微結構間的對比度，使標本結構更加清晰可辨。是介于光學顯微鏡與電子顯微鏡之間的一種顯微檢查技術，用于觀察生活細胞或未經染色細胞的形態結構。生物細胞無色透明，細胞內各種結構間的反差很小，在一般光學顯微鏡下難以清晰觀察到細胞的輪廓及內部結構，必須使用相差顯微鏡
顯微鏡的光學系統
顯微鏡，最重要的指標是清晰度要高。沒有清晰度，放大倍數便毫無意義，這取決于光學系統，顯微系統雖然都是由物鏡目鏡組成，但是系統不同 ,效果大不相同，就好象普通電視和數字電視，都可以看，檔次效果卻不一般。目前各種顯微鏡主要分二大類型光學系統：
1、有限遠顯微光學系統——普通。
2、無限遠顯微光學系統——清晰度高，國外如德國、日本、美國的儀器設計采用。
電子顯微鏡
提高顯微鏡分辨率的途徑之一就是設法減小光的波長，或者，用電子束來代替光。根據德布羅意的物質波理論，運動的電子具有波動性，而且速度越快，它的“波長”就越短。如果能把電子的速度加到足夠高，并且匯聚它，就有可能用來放大物體。
1938年，德國工程師Max Knoll和Ernst Ruska制造出了世界上第一臺透射電子顯微鏡（TEM）。1952年，英國工程師Charles Oatley制造出了第一臺掃描電子顯微鏡（SEM）。電子顯微鏡是20世紀最重要的發明之一。由于電子的速度可以加到很高，電子顯微鏡的分辨率可以達到納米級（10-9m）。很多在可見光下看不見的物體——例如病毒——在電子顯微鏡下現出了原形。
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（電子顯微鏡下的蚊子）
掃描隧道顯微鏡
用電子代替光，這或許是一個反常規的主意。但是還有更令人吃驚的。1983年，IBM公司蘇黎世實驗室的兩位科學家Gerd Binnig和Heinrich Rohrer發明了所謂的掃描隧道顯微鏡（STM）。這種顯微鏡比電子顯微鏡更激進，它完全失去了傳統顯微鏡的概念。
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諾貝爾獎：Ernst Ruska，Gerd Binnig和Heinrich Rohrer（從左至右）
分別因為發明電子顯微鏡和掃描隧道顯微鏡而分享1986年的諾貝爾物理學獎
很顯然，你不能直接“看到”原子。因為原子與宏觀物質不同，它不是光滑的、滴溜亂轉的削球，更不是達·芬奇繪畫時候所用的模型。掃描隧道顯微鏡依靠所謂的“隧道效應”工作。如果舍棄復雜的公式和術語，這個工作原理其實很容易理解。隧道掃描顯微鏡沒有鏡頭，它使用一根探針。探針和物體之間加上電壓。如果探針距離物體表面很近——大約在納米級的距離上——隧道效應就會起作用。電子會穿過物體與探針之間的空隙，形成一股微弱的電流。如果探針與物體的距離發生變化，這股電流也會相應的改變。這樣，通過測量電流我們就能知道物體表面的形狀，分辨率可以達到單個原子的級別。
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掃描隧道顯微鏡：圖中的“IBM”是由單個原子構成的
因為這項奇妙的發明，Binnig和Rohrer獲得了1986年的諾貝爾物理學獎。這一年還有一個人分享了諾貝爾物理學獎，那就是電子顯微鏡的發明者Ruska。
顯 微 鏡 的 調 整
為了更好地發揮顯微鏡的各種功能，提高工作效率，保證在顯微觀察及顯微攝象過程中取得最佳效果，使用人員必須了解和掌握顯微鏡正確的調試方法和使用方法。尤其是多功能高倍顯微鏡，能進行多種顯微鏡檢方法觀察，正確的試調方法和使用方法就顯得尤為重要。下面簡述調試及使用方法。
1. 顯微鏡照明光路系統的調整 為了使顯微鏡的視野能受到均勻而又充分的照明，在顯微鏡初次安裝和調試時，就必須把照明光路系統調整好，這是正確使用顯微鏡，并獲得正確、可靠結果的重要手段和最基本的要求。此外，正確掌握照明光路系統的調整，是使用顯微鏡過程中更換光源燈泡后所必經的步驟，也是在日常使用過程中不時地檢驗顯微鏡性能的必要手段。顯微鏡照明光路系統的調整主要有以下4項內容：
(1) 照明光源燈室在顯微外的初步調整
① 首先將燈室的外殼打開，壓彈簧夾子將鹵素燈泡裝入插座中，安裝時避免手指直接接觸燈泡（可用柔軟的布或紙隔住），以免燈泡上留有指紋等臟物，影響燈泡的使用壽命。
② 把燈室擺在桌面上，接通電源后，用專用的螺絲刀調節燈的調焦旋鈕孔（標有“←→”），使燈絲投影在1-2m外的墻上，將燈絲成像調至清晰；然后調節燈的高低位置調節絲孔（標有“──”）使燈絲位置高低適當；再調節燈的左右位置調節螺絲孔（標有“──”），使燈絲左右位置合適。
(2) 光源發光體（燈絲）在顯微鏡內位置的檢驗和校正 目的是為了把發光體的像端端正正地調入物鏡的視域范圍內，從光源的角度去確保顯微鏡的視域受到充分而均勻的照明，這是調整庫勒照明系統的前提條件。
(3) 庫勒照明（Kohler）系統的正確調整 顯微鏡的正確調試，主要工作之一是照明光路系統的調整，而其中的關鍵是庫勒照明系統的調整。對于每一位使用顯微鏡的人員，特別是作顯微照像的人員來說，應該對庫勒照明系統的原理及其調整步驟有一定的了解和掌握，才能充分發揮顯微鏡應有的功能，拍出來的照片才能在效果上比較一致而又完善。
庫勒照明系統的原理簡單來說就是：光源發光體上任意一點發出的光，可以照明顯微鏡的視域范圍，而光源發光體上每一點所發出的光匯集起來，在顯微鏡的視域中就實現了非常充分而又均勻的照明。 調整庫勒照明系統的目的，是為了使所觀察的視域能獲得均勻而又充分的照明，防止雜散光對照像系統造成影響或干擾，以免照像時在底片形成灰霧。 庫勒照明系統調整好以后，整個視域照明均勻，拍攝的顯微照片明亮清晰，反差正常。在日后使用過程中應特別注意：
a. 視場光闌不可任意開大，但可隨物鏡倍數的增大而將視場光闌收小，隨物鏡倍數的減小而
b. 聚光鏡的高低位置不準亂調，否則會破壞已調整好的庫勒照明系統；
c. 關于物鏡倍數與視場光闌大小配合問題，在實際使用過程中，作為一般觀察不一定要收小或開大視場光闌，但作顯微照相時，為了避免雜散光線對照相系統的干擾，以便能拍攝到較完善的照片，則應在使用每一個倍數的物鏡時，把視場光闌調節到正好消失于所觀察的視域邊上，這是比較繁復的工作，但又非做不可。較為簡便的方法是把與各個倍數物鏡相對應的視場光闌事先調整好，并作好記號，以后使用時根據記號直接調至相應的位置。
(4) 孔徑光闌的正確使用 由于聚光鏡的孔徑光闌可以影響顯微鏡的分辨率，使用時應掌握正確的使用方法。過去由于對孔徑光闌的認識不足，往往把它當作是調節視野亮度的工具。雖然調節孔徑光闌在一定程度上可以改變視野的亮度，但會直接影響成像的反差、對比度及分辨率，在使用過程中應盡可能避免。
為了發揮聚光鏡孔徑光闌的作用，以便在觀察時，尤其在作顯微照相時獲得最佳分辨率，在每換用一個倍數的物鏡時，在樣品調焦清晰后，需要調節孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑（物鏡孔徑像）的2/3 。
2. 顯微鏡成像光路系統的調整及顯微鏡檢術概要
顯微鏡成像光路系統的調整，是根據不同顯微鏡檢術的需要而進行的。所謂顯微鏡檢術（microscopy），概括而言就是以顯微鏡觀察樣品時所使用的照明方法，以及如何使樣品所成的像能獲得更良好反差的技術與方法。以下簡述顯微鏡檢術中已成熟的幾種方法及對應的顯微鏡成像光路系統的調整方法。
(1) 透射光明視野（brightfield）
這是自顯微鏡發明以來最傳統、最普遍的應用方法。 基本部件：
a. 物鏡：任何物鏡都可作明視野觀察；
b. 聚光鏡：各種聚光鏡均可，最好配有孔徑光闌。
調整方法：在上述顯微鏡的庫勒照明系統調整好后，即可應用明視野法。
適用范圍：所有已染色的組織切片、血液涂片等。
注意事項：
a. 使用明視野方法觀察時，一定要將庫勒照明系統調整好；
b. 視場光闌不可任意開大，使用10×、10×以下和10×以上物鏡時，要將聚光鏡前端透鏡分別擺事實出和擺進光路中；
c. 不可用聚光鏡的孔徑光闌來調節視野的亮度，更不要亂調聚光鏡的高低位置，否則，會降低顯微鏡的分辨率和破壞已調整好的庫勒照明系統；
d. 作顯微照相時，每換用一個倍數的物鏡，就要調節聚光鏡的孔徑光闌，使它的大小正好等于所用物鏡數值孔徑的2/3 。
(2) 落射光激發的熒光法（簡稱為落射熒光法）
是近代顯微鏡檢術中新發展出來的一種強有力的反差增強法。它將激發熒光用的光源改在物鏡的上方，光由物鏡上方經反光鏡射入物鏡去激發樣品，從樣品上被激發的熒光經物鏡成像并穿透反光鏡而由目鏡觀察。該方法較簡便，效率高，50W的光源強度比透射熒光法的250W還強。
熒光方法是利用波長較短的紫外光、紫光、藍紫光、藍光及綠光等去激發樣品，只要樣品中含有可產生熒光的成分，它便吸收短波的激發光而釋放出波長較長的熒光。不同物質只能吸改特定波長的激發光，而釋放的熒光也會有特定的波長，因而用作特異性的鑒定十分有效，如某些致病的細菌和螺旋體，受紫外光激發后能發出它們特有的熒光，很容易作出鑒定，這種利用物質吸收激發光后放出特有熒光的方法稱為自發熒光法。某些物質自身不會吸收激發光，或吸收后不能釋放熒光，但可以吸收或吸附特定的熒光色素或染料，而這些特定的熒光色素或染料也只能吸收特定的激發光，再釋放出特定的熒光，從而間接地鑒別出某種物質，這稱為間接熒光法。上述熒光方法廣泛應用于醫學、生物學及工業的特異性研究和鑒別上。
顯微鏡的保養
顯微鏡是一種精密的光學儀器，價格普遍較高。從結構上看，顯微鏡由許多光學部件和較精密的金屬零件組成，在使用過程中應特別注意做好保養工作。
1. 嚴格按照有關操作規則使用顯微鏡，避免因使用不當造成損毀。
2. 顯微鏡在儲存和使用過程中，普遍存在著生霉起霧問題，霉和霧會使顯微鏡的視場模糊，分辯率下降。為了使顯微鏡保持良好的工作狀態，延長使用壽命，顯微鏡的工作環境應保持清潔、干燥、防塵。
3. 顯微鏡在每次使用完畢后應及時做好清潔工作，特別是目鏡、物鏡等容易污染的光學部件，如發現表現表面有灰塵、指紋、臟物等，應及時用鏡頭紙清潔干凈。
4. 顯微鏡工作室最好能安裝空調、抽濕及防塵裝置。
5. 如發現光學部件內部有生霉等現象，最好及時聯系廠家派人清潔、維修。
