作者：荷葉
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上次荷葉介紹了給常規研究套路加個“高大上”的理論假說來升華文章的檔次，但是很多時候沒有這種理論假說怎么辦呢？今天荷葉借一篇研究腫瘤內T細胞的文章一窺其研究套路的升華。
文章梗概：腫瘤抗原特異的CD8+T細胞是殺傷腫瘤的主力細胞群，但是腫瘤中的CD8+T細胞常常“發揮失常”。
Ying Zhang等通過研究了在腫瘤微環境中黑色素瘤抗原特異的CD8+T細胞的變化，發現在低氧、低糖的腫瘤微環境中CD8+T細胞利用脂肪酸分解代謝供能，維持CD8+T細胞殺傷能力；同時他們還發現促進脂肪酸代謝的PPAR激動劑能夠與PD-1抗體相互協同抑制腫瘤生長。研究成果發表在2017年9月的《Cancer Cell》上。
常規研究套路
第一步，獲得腫瘤抗原特異的TILs。
1）以黑色素瘤細胞系B16BrafV600E皮下荷瘤3天后，利用腺病毒系統表達黑色素瘤特異的抗原表位MAA（Trp-1455-463）和E7免疫小鼠；
2）利用OT-1轉基因小鼠（表達OVA抗原表位），皮下接種B16OVA（表達OVA的B16細胞）。研究發現以腫瘤疫苗免疫的小鼠腫瘤生長緩慢。
第二步，觀察、檢測隨著腫瘤進展腫瘤特異CD8+TILs的變化。作者從細胞數目、功能和形態等方面展開研究。
研究發現隨著腫瘤進展，CD8+TILs細胞數目逐漸減少，同時PD-1和LAG-3免疫檢查點表達水平逐漸升高。對CD8+TIL的功能研究發現，其顆粒酶GrmB、IFNr和穿孔素Perforin表達水平下降。
作者進一步研究發現隨著腫瘤進展CD8+TILs的線粒體膜電位降低，而線粒體ROS升高。透射電鏡觀察了線粒體的超微結構，發現腫瘤生長時間長的CD8+TILs的線粒體腫脹，線粒體嵴減少，這些結果提示TILs的線粒體隨著荷瘤時間的延長而發生改變。
第三步，探討在腫瘤微環境中CD8+TILs發生這些變化的原因。由于腫瘤細胞的快速增殖能力，消耗大量的氧氣和葡萄糖（有氧糖酵解），因此腫瘤微環境常常是低氧、低糖的。研究發現TILs細胞HIF1α表達水平隨腫瘤進展而升高，HIF1α下游分子Glut1表達亦升高，這些提示TILs隨著腫瘤進展而逐漸缺氧。進一步分析血清、荷瘤14天和30天的腫瘤組織的血糖水平，發現隨著腫瘤進展腫瘤內血糖逐漸降低。
為了明確HIF1α在TILs和腫瘤中的作用，作者敲低CD8+T細胞的HIF1α的表達，發現敲低HIF1α后T細胞的殺傷能力增強。T細胞過繼實驗在體內證實敲低HIF1α能夠抑制腫瘤的生長。
研究套路之升華
很可能大多數的研究者研究到這就接近尾聲了，有表型，有機制，還做了體內的挽救實驗，發個7-8分的文章還是不成問題的。但是這篇文章的作者沒有淺嘗輒止。
第四步，作者沒有局限于HIF1α，而是將HIF1α作為一個引子，換了個研究角度，從代謝的層面出發，繼續深入研究低氧、低糖的腫瘤微環境中CD8+TILs發生變化的原因。作者發現敲低HIF1α后TILs的代謝發生改變：糖酵解相關酶表達下降，脂肪酸代謝相關酶升高。
作者轉換研究角度，分析了CD8+T細胞低糖、低氧環境的代謝表達譜，發現葡萄糖攝取、糖酵解相關基因表達下降，而脂肪酸攝取、脂肪酸代謝相關基因表達升高。
通過同位素標記跟蹤13C的去向，作者在腫瘤模型的TILs中驗證表達譜實驗的結果，CD8+TILs隨著腫瘤進展逐漸由脂肪酸分解代謝供能。同時對人腫瘤樣本的研究發現，黑色素瘤轉移灶內脂肪酸的含量增高，進一步提示脂肪酸分解代謝在腫瘤進展中的作用。
第五步，TILs的脂肪酸代謝特征如何影響腫瘤呢？作者通過PPARα的激活或抑制觀察脂肪酸代謝對TILs功能的影響：發現PPARα激動劑fenofibrate能促進TILs向腫瘤組織的浸潤，提高CD8+T細胞的殺傷能力，抑制黑色素瘤的生長。
而PPARα敲除后TILs的功能顯著下降，GrmB、IFNr和Perforin表達水平明顯下降。
第六步，研究了調節代謝藥物與腫瘤免疫療法相結合療法的可行性。作者發現腫瘤微環境能夠影響TILs免疫檢查點的表達水平：HIF1α與LAG-3的表達呈正相關（可能與LAG-3啟動子上有HIF1α的結合區有關），PPARα與PD-1的表達呈正相關。
抑制免疫檢查點抗體與代謝藥物聯合作用效果如何呢？研究發現PD-1抗體治療不影響TILs的脂肪酸代謝。但是PPARα激動劑fenofibrate能夠協同PD-1抗體增強腫瘤治療的效果。
綜上所述，本研究發現在低糖、低氧的腫瘤微環境中CD8+TILs激活PPARα信號和脂肪酸的分解代謝，加速脂肪酸的分解代謝（燃燒脂肪）能夠協同PD-1抗體增強腫瘤治療效果。
科研狗們，你是否有這樣的經歷：當我們千辛萬苦終于確認了一個表型，但是深入研究分子機制的時候常常力不從心，越做方向越窄，最終圍繞著某個分子打轉，盡管最終發了一篇paper，但是連你自己都不很自信，“我找的這個分子是主要機制嗎？”如同本篇文章，大多數人很可能就會圍繞HIF1α繼續研究了，其創新性就不夠。但是跳出這個窠臼，從更高層面研究——從HIF1α轉到脂肪酸代謝，妥妥的高分文章。
苦惱于分子機制研究的科研狗們，不甘于發個低分文章的科研狗們，換個研究角度大膽的試一試吧！
參考文獻
1. Zhang Y, Kurupati R, Liu L, Zhou XY, Zhang G, Hudaihed A, Filisio F, Giles-Davis W, Xu X, Karakousis GC, Schuchter LM, Xu W, Amaravadi R, Xiao M, Sadek N, Krepler C, Herlyn M, Freeman GJ, Rabinowitz JD, Ertl HCJ. Enhancing CD8+ T Cell Fatty Acid Catabolism within a Metabolically Challenging TumorMicroenvironment Increases the Efficacy of Melanoma Immunotherapy. Cancer?Cell. 2017 Sep 11;32(3):377-391.e9. doi: 10.1016/j.ccell.2017.08.004.
2. Bailis W, Shyer JA, Chiorazzi M, Flavell RA.No Oxygen? No Glucose? No Problem: Fatty Acid Catabolism Enhances Effector CD8+?TILs.Cancer Cell. 2017 Sep 11;32(3):280-281. doi: 10.1016/j.ccell.2017.08.013.
