編輯：麥子
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胰腺癌素有“癌王”之稱，所過之處，九死一生。所以研究者們也在探尋它活動的蛛絲馬跡（生物標志物），能夠及時發現它的窩點和動向，便于迅速準確地出擊。流調發現，我國的胰腺癌發病率越來越高，且有年輕化趨勢。如果早發現、早干預，5年存活率能有所提高達到15%-25%。所以我們需要找到胰腺癌早期、特異性的生物標志物。
復旦大學附屬上海市公共衛生臨床中心的汪進教授，在剛剛結束的生物標志物與液體活檢論壇上，向大家分享了他的研究團隊在胰腺癌生物標志物方面的工作，給我們帶來不少啟示。
我們知道，胰腺癌的發病因素中，遺傳物質的不穩定性有很大的關系，包括一些非編碼RNA（ncRNA）的改變。而血循環中的外泌體攜帶有腫瘤相關的ncRNA，瘤抑制基因的功能，且在腫瘤細胞中有異常表達。汪教授的團隊便考慮從外泌體中的ncRNA入手，尋找可用于液體活檢的生物標志物。
研究組考慮了circRNA、lncRNA、microRNA，但因為circRNA在外泌體中含量很少，很難檢出，而lncRNA需要擴增，提高了成本；microRNA（miRNA）除了避開以上兩個缺點外，還有在血循環中穩定，不易被RNA酶降解的特性，為研究帶來方便，所以最終選定了miRNA進行深入探索。
既然目標是無創或微創的液體活檢，首先就會想到從臨床上常用作檢測標本的體液中尋找，主要是血漿、胰液、囊液，研究組就兵分三路，從這三種體液中尋找有意義的microRNA；第四第五路分別是meta分析和生物信息學。
血漿 -探針法
汪教授的工作始于2009年，采用TaqMan探針法進行表達譜分析。研究組收集了49例胰腺導管癌（PDAC）和36例對照組血漿，分離出RNA進行檢測，得到4個與對照組有明顯差異的miRNA。
圖A-D分別為miR-21、miR-210、miR-155和miR-196a在對照組和PDAC組的FoldChange
接下來對這4個microRNA做了ROC曲線，計算AUC，評價其診斷效率。它們單獨使用的AUC在0.62-0.69之間，而聯合應用的AUC能達到0.82，有了顯著的提高。
A-D分別為4個microRNA的ROC曲線，E為聯合應用的ROC。
此后為了進一步證實其臨床應用價值，又擴大樣本量做了雙盲實驗，4個microRNA聯用的為0.75，若加上傳統的CA 19-9，則能達到 0.93。
胰液– 微陣列
從胰液中尋找標志物時已是2014年，此時已經有了研究基礎，便能拿到更多的研究經費，可以做用更高大上的微陣列方法了~該研究納入88位患者，分為訓練集（training set）和驗證集（validation set）。
訓練集有PDAC組6個樣本，對照組為來自6個非胰腺疾病、非健康患者（non-pancreatic, non-healthy, NPNH）的2個混合樣本。收集胰液做了miRNA微陣列，對Fold Change在1.5以上的49個miRNA做了層次聚類分析，找到4個有價值的miRNA，包括原來報道過在PDAC組織中過表達的miR-205和miR-210，還有未報道的miR-1247和miR-492作為新發現的標志物。
用qRT-PCR對這4個候選miRNA進行了初步驗證，PDAC組和NPNH組有明顯差異。接下來就要在更大的驗證集中進行驗證。驗證集包括PDAC組44例，CP（慢性胰腺炎組）19例，NPNH組13例。
圖為4個miRNA在各組的Fold Change，雖然有些miRNA的CP組和PDAC組差異不明顯，但和對照組還是有顯著差異。
當然還是要作ROC曲線來評價它們鑒別PDAC和NPNH的效率。除了4個microRNA，也同時做了CA 19-9，以及5者聯用的ROC曲線。驚詫的發現，5者聯用可使特異性達到100%，AUC也達到了0.99，而4個miRNA聯用的AUC為0.92。
A：4個microRNA、CA 19-9以及聯合應用的ROC；B：綠色為miR-205和miR-210同時高水平（中值或以上）的患者的總體生存曲線，藍色為二者非同時增高（即只有一個高或兩者都不高）的患者的生存曲線?？梢姶硕呗摵蠎糜信袛囝A后的意義。
囊液– NGS
做囊液中標志物的搜查時，應用了二代測序（NGS）進行分析。為了早期診斷兩種癌前病變的惡化，即胰腺導管內乳頭狀黏液腫瘤（IPMN）和胰腺囊液性粘性腫瘤（MCN），研究組選取了17例患者，分為低風險組（低/中級異型的IPMN和MCN）6人，高風險組（高級異型）8人，胰腺腺癌（PA）組3人。
先從2個低風險組和2個高風險組樣本中檢測出13個在高風險組上調的miRNA，2個下調。不過樣本量太少，經過偽發現率（FDR）校正后，并不是所有miRNA的差異都有統計學意義。
再用qRT-PCR在所有17個樣本中驗證miR-216a和miR-217這兩個有腫瘤抑制作用的miRNA。結果miR-216a在低風險組 vs 高風險組、低風險組 vs 胰腺癌組有顯著差異，而高風險組vs 胰腺癌組則沒有差異。這也說明它有潛力區分良性和高風險的癌前病變。miR-217在三組中沒有差異，只是有相似的趨勢，擴大樣本量也許會出現更清晰的結果。
這倒是一個有意思的現象。miR-216a和miR-217據報道在腫瘤組織中是低表達的，本研究確實觀察到它們在囊液中表達增高，也經過了qRT-PCR的驗證。這是為什么呢？研究組百思不得其解。會不會是腫瘤組織排出來了？還是其他什么機理？可能需要進一步研究。
Meta分析和生物信息學
最后，汪教授還特別鼓勵學生利用網絡上已發表的成果進行二次分析，即meta分析和生物信息學方法。Meta分析可以通過質控將零散的數據匯總成更大的數據集，得出更有說服力的結果；而生物信息學分析就像投資前的調查，找到最有投資（分子生物實驗）價值的分子。
這是2017年做的meta分析，納入了29個關于胰腺癌與miRNA的研究，做了SROC（summary ROC）曲線，AUC為0.89。
A：總ROC；B：Deek發表偏倚檢測。
生信方面，這篇2016年的文章挖掘了GEO、Oncomine兩大數據庫中關于胰腺癌與miRNA和mRNA的數據。
從GEO中提取了5個miRNA表達譜數據集，用其中的2個發現集（discovery set）做個交集，得到26個共有的差異表達的miRNA（圖A），然后在3個驗證集中進行確認（圖B）。圖C是這些miRNA的表達情況。
然后從Oncomine數據庫中找到5個關于胰腺癌和基因表達（mRNA）的研究的數據集，把它們的異常表達基因也做個交集，得到260個共同的差異表達基因。
接著做了IPA通路分析，找到這26個miRNA是靶向260個基因中的53個，接著對這53個基因進行網絡與途徑分析，發現它們參與胰腺癌相關的4個基因網絡和5個經典途徑，進一步求證了它們作為胰腺癌生物標志物的可行性。
研究組還做了文獻回顧，發現這些基因所編碼的蛋白中，有6個會分泌到血漿或血清中，更有發展為液體活檢生物標志物的潛力。這樣通過生信工具來找下一個研究目標，不就省事多了~
不過這篇生信的文章有點遺憾，忘了感謝NIH的資助，還把作者寫漏了，只好撤了……
參考文獻：
MicroRNAs in Plasma ofPancreatic Ductal Adenocarcinoma Patients as Novel Blood-Based Biomarkers ofDisease
Circulating microRNAs inPancreatic Juice as Candidate Biomarkers of Pancreatic Cancer
Next generation sequencing ofpancreatic cyst fluid microRNAs from low grade-benign and high grade-invasivelesions
Clinically relevant circulatingmicroRNA profiling studies in pancreatic cancer using meta-analysis
Retracted: Identification ofNovel Biomarkers for Pancreatic Cancer Using Integrated Transcriptomics WithFunctional Pathways Analysis
