小細胞肺癌（SCLC）約占所有肺癌的10～15%，且惡性程度高、轉移擴散較早，大多數SCLC患者確診時已有轉移(1)。SCLC患者初期對鉑類化療藥很敏感，但也較易出現耐藥，雖然一部分患者能夠受益于化療和免疫療法的“攜手抗敵”，但且生存期超過1～2年的患者極少(2)，仍需尋找指導臨床決策的生物標志物(3)。
近年來研究根據不同主要轉錄因子的表達將SCLC分為四個亞型，不同亞型呈轉錄組學差異性表現，且隨著治療出現動態變化(4, 5)。然而，上述的轉錄亞型與患者預后相關性尚不清楚。為解決這個問題，科研人員們將目光瞄向了近年火熱的液體活檢，而在SCLC發展過程中作用重要的DNA甲基化就可以成為目標(6)。
近日，來自英國曼徹斯特大學的Caroline Dive、Dominic G. Rothwell和來自美國紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的Charles M. Rudin帶領的團隊，就研發了一套無創性、靈敏且應用范圍廣泛的檢測全基因組DNA甲基化的流程，通過檢測患者外周血游離DNA（cfDNA）甲基化情況，指導SCLC分期、分型鑒定以及疾病監控，研究發表在了Nature Cancer上。
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那么，這項有望進行臨床轉化的技術手段是怎么來的，又將如何應用呢？
研究人員首先在二代測序（NGS）的基礎上，構建了T7-MBD-seq測序方法。利用此方法對97例SCLC患者來源腫瘤組織異體移植組織（PDX）或循環腫瘤細胞來源移植組織（CDX）和13例健康肺組織進行測序。
測序結果顯示，CDX/PDX和健康肺組織的甲基化模式存在明顯的不同，且這一方法所測結果與利用Illumina平臺對原發腫瘤和健康肺組織測序結果相一致，提示了T7-MBD-seq測序方法的可靠性（圖1）。
圖1. T7-MBD-seq與Illumina平臺對不同SCLC腫瘤組織和正常肺組織甲基化測序結果一致
研究人員進一步利用此方法，對78例SCLC患者和79例非腫瘤來源的cfDNA進行測序。結果發現，此方法可對1.83-34.4 ng的cfDNA進行測序，且甲基化富集分數與50 ng CDX/PDX樣本相近（圖2左）。同時，同一患者來源CDX和cfDNA的測序結果也顯示，甲基化模式高度一致（圖2右）。以上結果提示，應用T7-MBD-seq測序方法檢測cfDNA甲基化，并將其作為SCLC患者的診斷標志物，具有可靠的發展前景。
圖2. 1.83-34.3 ng cfDNA與50 ng CDX/PDX標本所測甲基化模式相近（左）；同一患者來源cfDNA與CDX所測甲基化模式高度一致（右）
在此基礎上，研究人員利用更多的樣本數據反復訓練該方法模型，隨后對119例cfDNA樣本進行檢測，結果發現，該模型能夠高效區分SCLC患者與正常肺組織人群，甚至能夠區分出SCLC患者是處在局限期（LS-SCLC）還是廣泛期（ES-SCLC），準確率分別高達93%和100%（圖3）。
圖3. T7-MBD-seq檢測cfDNA甲基化準確區分健康肺組織人群和局限期、廣泛期SCLC患者
而按照患者的疾病分期不同來劃分時，cfDNA甲基化檢測相對細胞拷貝數變異（CNA）檢測（圖4），在檢測LS-SCLC的靈敏度和特異性上明顯更優，這就提示cfDNA甲基化檢測更有利于篩查出較早期、低腫瘤負荷的SCLC患者。
圖4. T7-MBD-seq檢測cfDNA甲基化靈敏度優于拷貝數變異檢測
為進一步挖掘cfDNA甲基化檢測的臨床應用價值，研究人員探究了其與SCLC患者生存期的關系。結果發現，根據cfDNA甲基化分數中位數將患者分為兩組，甲基化分數低的患者總生存期要顯著長于甲基化分數高的患者（20.6個月 vs. 8.5個月，HR=3.60，見圖5）。
圖5. cfDNA甲基化分數低的患者，則總生存期長
考慮到SCLC分子分型對SCLC患者的治療、預后具有重要意義，研究人員又對模型進行了一系列訓練，并檢測了cfDNA甲基化與分型的相關性。結果顯示，根據相應的cfDNA甲基化檢測情況，有助于準確區分患者屬于ASCL1、NEUROD1型還是雙陰性分型（圖6）。
圖6. 根據cfDNA甲基化檢測情況與已知分子分型進行對應分析
大多數SCLC患者發現時已經是進展期、出現轉移病灶，預后不夠理想。因此，挖掘能夠輔助早期診斷及監測這一疾病進展的無創性生物指標及相關檢測方法將無形中挽救許多肺癌患者的生命，同時也將大大降低家庭和社會負擔。如果說上述問題是一片荒漠，那么本項研究即是在荒漠中種下一棵樹。
當然，本次研究的結論仍需要更多驗證，尤其是在更大的患者隊列中驗證，提高準確性和穩定性，這樣才能早日將這一技術手段真正應用于臨床，為SCLC患者提供更精準的治療建議和預后判斷提供支持。
參考文獻:
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4.C. M. Rudin, J. T. Poirier, L. A. Byers, C. Dive, A. Dowlati, J. George, et al. Molecular subtypes of small cell lung cancer: a synthesis of human and mouse model data. Nat Rev Cancer. 2019;19(5):289-97.
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6.A. F. Gazdar, P. A. Bunn, J. D. Minna. Small-cell lung cancer: what we know, what we need to know and the path forward. Nat Rev Cancer. 2017;17(12):725-37.
