蛋白質結構測定的未來
已有 4087 次閱讀 2014-2-15 20:36|系統分類:
科研筆記馬上就要畢業了，我的方向是生物大分子結構，所以寫了一個蛋白質結構測定的未來。最初寫這個，其實就是想向身邊的人解釋一下我在做什么以及我打算做什么，所以用的語言很通俗，例子也是大家熟悉的，可是后來因為功力不夠的原因，不免寫得復雜了。
簡單地說明一下我的背景，在北京高能所讀凝聚態專業的博士，在北京同步輻射裝置生物大分子線站值過班，同時在結構生物實驗室（后來叫蛋白質中心）干過活，主要工作內容是用同步輻射方法研究紅細胞和血紅蛋白，目標是想看看細胞內血紅蛋白的狀態。
雖然題目很大，其實就是我對于蛋白質結構的一些理解，也沒有新東西，如果不是這個方向的也許看了會了解一二。是這個方向的前輩，對于錯誤的地方請多多指教。
1、蛋白質結構及其與功能的關系
既然要說未來，就要說一下現狀。蛋白質是生命活動的載體。機體中的每一個細胞和所有重要組成部分都有蛋白質參與，生命活動最終都要靠蛋白質實現。舉個例子，呼吸活動。我們每天都在吸入氧氣，排出二氧化碳。正是氧氣幫助我們把吃進去的食物變成我們進行活動的能量。通過氣管吸入肺中的氧氣要通過血液輸運到身體組織中，這里面就有一種蛋白的功勞：血紅蛋白。氧氣結合到血紅蛋白上，到組織的時候，就將氧釋放出來，被組織吸收！同時將二氧化碳運走。見圖1，這是血紅蛋白的氧解離曲線，如果拿血液做實驗，得到的結果也是一致的，這是因為真正起作用的是血紅蛋白。圖中隨著溫度和pH值的變化，氧結合的比例會有所不同，正是這種細微的調節，可以決定身體不同部位接受氧的量。
圖1，血紅蛋白的氧解離曲線
前面只是說明蛋白質很重要，那么跟結構有什么關系呢？蛋白質的結構決定了它功能的實現。我們看細胞，里面包含有無數個蛋白質。其實是有一個大致的數的，人的紅細胞直徑通常是6μm～8μm，血紅蛋白的直徑約為6nm，細胞內32%的體積為血紅蛋白，就算按紅細胞最小直徑算，又因為紅細胞是扁平的，也可以知道一個細胞內至少有一億個血紅蛋白。這里面的問題就是一個細胞中可能有成百上千種蛋白，而且每一種都有大量的拷貝，它們是如何穩定共存的呢？答案是在穩定的溶液環境中，蛋白有一個穩定的結構。這里面還是先舉血紅蛋白為例子，見圖2。圖中a為血紅蛋白的整體結構，由四個相似的部分（亞基）構成，這些亞基之間的相對位置會發生變化，引起氧結合能力的變化。圖b顯示的氧結合部位的放大結構，氧就結合在血紅素平面上。
圖2，血紅蛋白的結構
現在人們已經測定了將近十萬個蛋白質結構。廣為人知的事實是，蛋白質的基本組成單元并不是原子，而是氨基酸。就如我們現在砌房子不會直接用泥土，而是用磚塊，這樣更省事。在氨基酸之上，幾個或者十幾個氨基酸會形成穩定的二級結構，比如圖2a中的螺旋。這些結構通過一定的方式折疊才能形成穩定的三級結構，有了生物活性，就是前面所說的亞基。有些蛋白是由多個亞基構成的，這些亞基通過氫鍵、疏水作用相互連接，一起完成更重要的功能。但我們不要忘了，所有的一切都是由原子構成的。
在這里再舉一個結構的例子。1998年，R. Mackinnon解出了離子通道的結構，然后獲得了2003年的諾貝爾獎。一個多世紀前，Wilhelm Ostwald首先提出，生物體內的電信號是離子進出細胞膜而產生的。到了1950年代初， Alan Hodgkin和Andrew Huxley發現，這些離子是鉀離子和鈉離子。這樣的敘事只是交待了一個時間線，神經信號是一種電信號，這種信號是利用細胞內的外的離子濃度差造成的電勢差形成的，但是這種離子濃度差并不能用簡單的滲透壓和擴散來解釋，需要有一種機器通過消耗能量使鉀離子進入細胞內，同時將鈉離子排出。這樣的裝置還要在一定的電勢作用下開啟，以維持神經信號的傳遞。這里另外一個重要事實是，神經信號在細胞內的傳播是不衰減的。Mackinnon發現的就是這樣一種機器的結構（見圖3）。四個類似的亞基組成一個桶狀結構插入細胞膜中，中間留有一個通道供離子進出，圖A表明一次進入的是3個鉀離子。圖B將離子通道突出了出來。問題在于鉀離子比鈉離子大，為什么鉀離子能進來，鈉離子進不去呢？離子在溶液中存在并不是單個原子的形式，而是由水包裹的，離子通道能夠脫去鉀離子的水“外衣”，即左側的GYG結構，但是對鈉離子沒有辦法。這個通道的大小是0.27nm，鉀離子的大小。
到這里簡單說明了蛋白質的結構以及結構對于揭示功能的重要性，下面要說的就是現在測定蛋白質結構的方法，前面的結論也是來自于這些方法。然后會分析一下這些方法的優劣，最后是面臨的問題和突破方向。
圖3，KcsA的結構（PDBid：1BL8）
2、結構測定的方法
有個數據庫就叫蛋白質結構數據庫（protein data bank，PDB），表1統計了它收集的蛋白質結構數目，使用的方法?？梢钥吹街饕姆椒ㄊ荴射線，其次是核磁共振（NMR），以及電鏡（EM），第四種是聯合使用多種方法，最后一項其他是中子散射。這里主要介紹前三種方法，而且以第一種為主。為什么？同步輻射就是一種X射線光源，第二它最主流，因為相對其他兩種方法，它有十分明顯的優勢。
Exp.Method
Proteins
Nucleic Acids
Protein/NA Complexes
Other
Total
X-RAY
8062115024194486321NMR
90241072197710300ELECTRON MICROSCOPY
508511700729HYBRID
5732163other
1554613178Total
90365263245692597591表1，PDB收集的結構統計
X射線其實是X射線晶體學的簡寫，一般使用的波長是1埃左右，也就是0.1nm。這個尺度剛好也是原子半徑大小。
X射線也是一種光，我們眼睛能看到東西也是因為光。物體發射或者反射光進入我們的眼睛，我們通過對光子的響應知道了物體的存在。你如何知道一張紙的厚度？一般紙張的厚度在0.1mm左右，就是100微米，100,000nm。你經常見到的尺子的刻度是多少？1mm，顯然你無法直接用尺子去量一張紙的厚度。需要一個跟測量的物體相一致的探針，這就是X光。我們可以用顯微鏡放大物體，看到細胞甚至是細胞器。但是可見光的波長是幾百nm，是無法直接看到原子。
晶體學的意思是，我們使用的樣品是晶體。這并不復雜，我們平時看到的食鹽、雪花都是晶體，世俗中最有價值的晶體當然是鉆石了，那是碳原子組成的晶體。如果你把木炭放在高溫高壓的環境下，輔以一定的條件，就能得到鉆石了。最重要的是樣品中原子的排列，在晶體中，原子或者分子按特定的順序搭起來，排列的整整齊齊，就如軍隊中閱兵方陣。
當X光照射到晶體上時，會引起散射。就是光波會激發原子發出同樣頻率的波，由于晶體中原子排列的有序性，在特定的方向上，散射的光得到了增強。圖4展示了Bragg方程的幾何關系。在兩個晶面上都發生了反射，遠場條件下，它們的光程差是，當這個光程差滿足光波長的n倍時才產生衍射。因為晶體是無數這樣的面的疊加，所以在這個方向上的光變得極強，三維條件下就是一個點。晶體學中還有一個跟Bragg方程等效的方程，勞厄方程，它從晶體的特性出發，構置倒晶格向量，只有當波矢是倒格矢的整數倍相加才能發生衍射。
圖4，Bragg方程的導出
為了進行蛋白質結構測定，首先需要將蛋白質進行結晶，然后在X光源上進行衍射實驗。衍射裝置如圖5a所示，一般晶體是裝在一個旋轉軸上，可以360°旋轉?，F在也很少用底片，比較常用的是成像板，同步輻射裝置上一般使用CCD，這樣讀寫速度更快，方便實驗的進行。圖5b給出的一張真正的蛋白質衍射點，圖中的白線叫beamstop，就是擋住X射線，以免直接打到CCD上。X光照到晶體上，被散射的部分很少，余下的都直接穿過晶體，如果不擋住的話會把CCD燒壞的。想象一下CT，就知道X射線的穿透能力了。圖b中你也會發現中間的點多一些，顏色也深一些。這就涉及到一個強度的問題。
一個電子對X光的彈性散射（Thompson散射），散射強度如下：
。
圖5，a，衍射裝置的幾何結構；b，一張蛋白質晶體的衍射圖
需要注意的跟質量的平方成反比，質子的質量是電子的1800倍，所以電子的散射強度比質子強得多，我們得到的信號主要來自于電子的散射。另外就是跟散射角度的關系，角度越高，散射越弱。當有多個電子的時候，電子之間的位置關系用來表示，波矢用來表示，散射出來的波就有一個相位關系，用電子密度來表示電子的位置，就有
CCD測量的是這個值的平方，從這個關系也可以知道，衍射點的強度是電子密度的傅里葉變換。當測得這些點的衍射強度之后，通過反傅里葉變換就可以得到電子密度。這里面的問題是相位的丟失，當原子數目很少的時候，可以直觀地猜出來原子的相對位置。原子數目很多的時候，相對位置的數目就是原子數的階乘，血紅蛋白有將近6000個原子，這個方法就失效了。所以人們想了很多辦法來解決這個問題，比如同晶置換、反常散射。而且由于計算機技術的發展，解結構變成一個非常成熟的技術。所以你會看到每年有越來越多的結構被解析出來。
核磁共振是指核磁矩不為零的原子核，在外磁場的作用下，核自旋能級發生塞曼分裂，共振吸收某一特定頻率的射頻輻射的物理過程。原子核處于分子內部，分子中運動的電子受到外磁場的作用，產生感生電流。這一感生電流在核上產生感生磁場，感生磁場與外磁場相互疊加，使核上受到的有效場發生變化。我們把這一現象稱為原子核受到了屏蔽。由于屏蔽作用使得同一種原子核由于所處的化學環境不同，核磁共振頻率略有不同，這被稱為化學位移，常以δ表示。屏蔽作用的大小與核外電子云密度有關，后者又與原子核的化學環境有關，因此可根據化學位移的大小，來考察原子核所處的化學環境，從而對化合物進行結構分析。
圖6是一幅真實的二維核磁共振譜，里面的藍色點代表該強度下的原子的化學位移信息。坐標軸ppm就是化學位移，通過使用同一參照樣品使得其獨立于外加磁場。我們所得到的是一系列這樣的原子間距信息，但是無法得到全局的結構，這樣就需要進行動力學優化。最后得到的結構模型就是一系列動力學最優解。
相對于晶體學，這種方法的局限性是不能測太大的蛋白質的結構，得到的結果也不如晶體學那樣可靠，優點在于是在溶液中進行的，不像晶體學需要結晶，這樣會使結構受到堆積力的作用，也會造成樣品制造上的困難。
圖6，二維核磁共振譜
電鏡的全稱是電子顯微鏡。使用的是電子作為探針，用電磁透鏡代替了光學透鏡并使用熒光屏將肉眼不可見電子束成像。為什么不使用透鏡來讓x光成像呢？原因在于硬X射線的穿透性，目前還無法做X射線透鏡。
圖7，a為掃描電子顯微鏡的構造圖，b為天花病毒的結構
電子打在樣品上，會激發出二次電子、或X射線等，通過探測二次電子可以得到當前位置的電子強度信息。然后移到附近，這樣就可以得到圖7b中的圖像。圖中的顏色是假彩色，真實的信息是二次電子的強弱。按照成像理論，這樣得到的只是一個樣品的截面，如果有許多全同的樣品，掃描得到不同截面的信息，就可以利用計算機技術將這些截面組合起來，得到樣品的三維結構。
這里面存在的問題是，電子的散射很強，很容易被空氣散射，所以需要高真空環境。這樣一來樣品就不能是活的。由于技術原因，目前最好的分辨率不到3埃，這和晶體學相比是有差距的。
3、蛋白質結構測定的未來
前面大致介紹了一下蛋白質結構測定的常用方法?？傮w來說，這幾種方法越來越成熟，每年測得的結構也越來越多。下表是截至2014年2月PDB數據庫中的結構數目，可以看到結構數目呈指數增長。國內而言，也有越來越多的生物學家進入結構測定這一領域，因為結構確實能解釋他們研究中的很多問題，加深對于生物意義的理解。
單純就結構測定而言，能解釋的問題是有限。一個蛋白長成一個樣子，然后我們說這樣就可以跟DNA結合，可以作為離子通道，可以跟某個小分子結合，這些在生物學實驗中可能就已經得到驗證了。給你一個蛋白結構，如果對于其在細胞中的定位以及功能了解很少的話，其實是很難講一個好故事的。這就是生物學家做結構的優勢。他們可能在細胞或者生化層面做研究，到了分子層面，以前的那些疑問可能都會得到解答。他原來就知道蛋白有某種特性，必須與DNA結合，拿到結構一看，蛋白質的凹槽正好可以結合DNA。某種疾病引起了基因突變，他把正常的和突變的蛋白結構一比較，就可以發現問題出現在什么地方。這是結構測定的一大前景。
前面已經說過電鏡和NMR的問題，晶體學的最大瓶頸在于結晶。結晶的方法是得到高純度的蛋白，然后將蛋白加入各種配好的溶液中進行結晶。具體哪個溶液能夠長出晶體是不知道的，只能不停地去嘗試。而且已經測得的結構如此之多，那些容易結晶的蛋白質可能已經被嘗試過了，現在的方向是復合物。由好幾個蛋白質通過相互作用構成的復合物一起實現一個功能，但是和單個蛋白相比，復合物之間的相互作用比較弱，這樣對溶液環境的要求就更高。也就是說更難找到結晶條件了，而且就算是長成晶體，由于復合物結構復雜，很難是完美晶體，衍射的分辨率就上不去。
回到結構本身。在小分子領域，量子化學的計算是相當精確的。但在蛋白質結構中，由于原子眾多，用量化計算的話計算量非常大，所以常用的分子動力學。通過構置分子力場，就是分子中原子相互作用規則，然后利用最優化方法，得到一個“能量”最小的結構。而為了兼顧精度和計算速度，人們會使用QM/MM這樣的組合，即在核心區域使用量化進行計算，而在外圍使用分子力學。蛋白質中的原子是作為一個整體存在的，配體結合在活性位點會影響整個蛋白的結構。很多蛋白使用ATP作為動力來源，ATP末端磷酸基團水解時，釋放出的能量是30.54 kJ/mol。這樣的能量夠離子泵運作一次。顯然，你結晶的時候是無法把ATP水解的過程固定住，NMR測定一個結構的時間要幾天。而一個電子在蛋白質中的轉移可能就在ps量級。這很好理解，一個反應中，中間態是不穩定，只有初態和末態才能大量存在，就如血紅蛋白中結合氧和沒有結合氧，你很難找到一個即將結合氧的結構。但是我們可以自己制造。
時間分辨的晶體學是在飛秒化學的基礎上發展起來的。利用飛秒激光作為時間基準，可以在反應之后的特定時間進行測量，這樣就可能得到反應中間態的信息。比如肌紅蛋白結合氧的實驗，但是氧和肌紅蛋白結合的能力不如CO（CO中毒的原因就在于此，結合到血紅蛋白之后不容易解離，造成氧輸運受阻），所以一般這類實驗采用的是結合CO的肌紅蛋白，使用特定頻率的光照，可以使CO脫離蛋白中的鐵原子，脫離之后CO是不是飛出結合的口袋呢？可以在解離之后特定的時間去測量紅外光譜，這樣響應時間很快。而要直觀地看到結構，則使用X射線，在150ps內，CO還是停留在肌紅蛋白的口袋中，大約在1ms之內會重新結合到鐵原子上。為了更快地進行測量，往往使用“白光”，這樣的衍射叫勞厄衍射，一張衍射圖就可能解出結構。顯然這樣的實驗也存在問題，比如使用晶體，這樣光解實驗變化的區域只能活性位點附近。
如果有一種方法能夠得到單分子的結構，那么就可以很方便地得到中間態。這就是X射線自由電子激光最誘人的應用。X射線自由電子激光（FEL）的基本原理是通過自由電子和輻射的相互作用，電子將能量傳送給輻射而使輻射強度放大。由直線加速器產生的電子束流，經過幾次壓縮后將能產生超短的脈沖長度(fs量級)，將為研究物質的微觀動態結構以及非線性過程提供前所未有的機會。
圖8是利用FEL進行單顆粒成像的示意圖。蛋白顆粒從一個質譜儀中噴出，一束相干X光照射上去，由于光束其高的能量，蛋白被擊碎。但是在被擊碎之前，已經將X射線散射出來，里面含有蛋白結構信息。這仍然是電子密度的傅里葉變換，可以反向重建蛋白質的結構?，F在的問題是一張圖的信號太差，需要許多張一樣的圖平均來增強信號，得到的仍然是結構的一個截面，這與電鏡類似，所以需要多張圖來重建結構。最大的問題是，高角度的散射信號非常弱，不到一個光子，于是分辨率也上不去。
使用更強的光源，更短的脈沖，以及更好的探測器，是否有可能使用一張圖就解出結構來呢？如果答案是能的話，那么要多強的光，多短的脈沖，多好的探測器？現在美國斯坦福的LCLS已經為用戶進行供光，位于德國漢堡的X-FEL和日本的SCSS都在建設之中。相關的實驗已經進行了幾十個，但對于單張圖成像方法和理論都需要更多的探索。
寫到這里，其實很多東西沒有寫明白，只是給出一個大致的輪廓。在單分子測量領域，光鑷和磁鑷對分子力學進行了很多有意義的測量；熒光能量共振轉移(FRET)已經成為檢測活體中生物大分子納米級距離和納米級距離變化的有力工具，在生物大分子相互作用時間分析有著廣泛的應用；而生物學家在生物大分子相互作用也有很多非常具有創造性的方法。總體來看，時間分辨的大分子結構測定只是我們對于分子的理解需要的更多信息的一種可能，但是是最直觀的一種！
圖8，單顆粒成像示意圖
